جيل من الخلايا الظهارية الآنف البشرية الماغنيسيوم فردية التليف الكيسي Transmembrane الموصلية منظم الدراسة
Summary
هنا يصف لنا وسيلة لتوليد الثقافات كروي ثلاثي الأبعاد للخلايا الظهارية الآنف البشرية. ثم يتم تحفيز الماغنيسيوم محرك منظم الموصلية التليف الكيسي Transmembrane (CFTR)-تعتمد أيون وإفراز السوائل، قياس التغير في حجم كروي لومينال كوكيل للدالة CFTR.
Abstract
في حين إدخال العقاقير المغير منظم الموصلية التليف الكيسي Transmembrane (CFTR) قد أحدث ثورة في الرعاية في “التليف الكيسي” (CF)، نموذج العلاج الموجه بالنمط الوراثي حاليا في استخدام نقائص عديدة. مجموعات الطفرة الأولى أو نادرة أو المداريين مستبعدة من التجارب السريرية نهائي. وعلاوة على ذلك، كما أدخل المخدرات المغير إضافية في السوق، ستصبح صعبة لتحسين الخيارات المغير لموضوع فردية. كل من هذه القضايا تعالج باستخدام نظم نموذجية الإكلينيكية المستمدة من المريض، وفردية للدالة CFTR والتحوير. الخلايا الظهارية الآنف البشرية (الاهناسى) مصدر يمكن الوصول بسهولة لانسجة الجهاز التنفسي لنموذج من هذا القبيل. وهنا، يصف لنا توليد نموذج كروي ثلاثي الأبعاد لدالة CFTR وتعديل الاهناسى الأولية باستخدام. الاهناسى معزولة من المواضيع بطريقة كسبها، توسعت في ظروف إعادة برمجة الشرطي، والمصنفة في ثقافة كروي. خلال أسبوعين من البذر، تولد ثقافات كروي الماغنيسيوم هني أنه يمكن حفز مع 3 ‘, 5’ دوري الادينوسين الأدينوزين (مخيم)-توليد يضع لتنشيط وظيفة CFTR. ثم هو كمياً تورم كروي كوكيل لنشاط CFTR. الماغنيسيوم هني الاستفادة من أصل كسبها، ومع ذلك الجهاز التنفسي الآنف خلايا لتوليد نموذج موجوداً، وشخصية تتصل ظهارة يعكس المرض معدلات الاعتلال والوفيات. بالمقارنة مع ثقافات هني واجهة الهواء السائل، الماغنيسيوم سريعة نسبيا إلى أن تنضج، مما يقلل من معدل التلوث العام. في شكله الحالي، يقتصر النموذج الإنتاجية منخفضة، على الرغم من أن هذا يقابل السهولة النسبية للحصول على أنسجة. الماغنيسيوم هني يمكن استخدامها لقياس موثوق بها وتميز نشاط CFTR على المستوى الفردي. سيتم تحديد دراسة جارية لربط هذا التحديد الكمي للاستجابة في فيفو المخدرات إذا الماغنيسيوم هني مؤشرا صحيحاً الإكلينيكية لاستجابة المريض للتحوير CFTR.
Introduction
التليف الكيسي (CF) مرض المتنحية القاتلة، وجسمية تؤثر على أكثر من 70 ألف شخص في جميع أنحاء العالم1. بسبب هذا المرض الوراثي تقصير الحياة الطفرات في الموصلية التليف الكيسي Transmembrane منظم للبروتين (CFTR)2. CFTR عضو في الأسرة كاسيت ملزم الادينوسين ثلاثي الفوسفات، ومهام كقناة أيون السماح بتحرك من الكلوريد والبيكربونات عبر أغشية قمي epithelia الاستقطاب متعددة بما في ذلك الجهاز الهضمي، الغدد العرقية، والجهاز التنفسي شجرة3،4، بين أمور أخرى. على هذا النحو، CFTR المختلة وظيفيا يؤدي إلى خلل إطار الظهارية، مع معظم الوفيات الناجمة عن أمراض الجهاز التنفسي1. في الرئة CF، فقدان مجرى الهواء يحركها CFTR سطح السائل (ASL) التنظيم ومخاط الإفراج يؤدي إلى مخاط سميكة وعرقلة مجرى الهواء والعدوى المزمنة، وإعادة عرض مجرى الهواء تدريجيا وفقدان وظيفة الرئة1،5.
وعلى الرغم من تحديد خلل CFTR كسبب للمرض، العلاج في قوات التحالف تركز تقليديا على التخفيف من الأعراض (مثل، العلاج باستبدال إنزيم البنكرياس، العلاجات تطهير مجرى الهواء)1. وكان ثورة هذا النهج مؤخرا بظهور رواية المداواة، يطلق عليه “المغيرون CFTR،” التي تستهدف مباشرة CFTR المختلة وظيفيا. هذا النهج قد تحول المشهد السريرية من إدارة أعراض للمرض–تعديل الرعاية ولكن يحمل عدة قيود6،،من78،9،10. النشاط المغير محددة إلى عيب البروتين المصاحبة لكل طفرة CFTR ومحدودة لتحديد السكان الوراثية11. هذا القيد هو مدفوعة بالطبيعة غير متجانسة من البروتين العيوب، ولكن أيضا بعمليات التجارب السريرية في مجموعات طفرة نادرة. وباﻹضافة إلى ذلك، فيما بين المواضيع مع الأنماط الوراثية المدروسة جيدا (مثلاً، F508del/F508del CFTR، أن الطفرة CFTR الأكثر شيوعاً)، هناك تباين واسع في المرض عبئا والمغير استجابة6،7،8 ،،من911.
للتغلب على هاتين المسألتين، اقترحنا المحققين استخدام نماذج مخصصة ل التجارب الإكلينيكية12. ويستخدم هذا المفهوم الأنسجة الخاصة بالمريض لتوليد نظام فردي السابقين فيفو نموذجي لاختبار المركب، التنبؤ في فيفو هذا الموضوع استجابة للعلاج بطريقة شخصية. بمجرد التحقق من صحتها، يمكن أن يستخدمها نموذج من هذا القبيل إلى الأطباء للعلاج الدقة محرك الأقراص بغض النظر عن الأساسية CFTR النمط الوراثي المريض.
الشعب الهوائية الظهارية (HBE) الخلايا البشرية التي تم الحصول عليها من أنسجة explant في وقت زرع الرئة المنشأة إمكانية مثل هذا النموذج لقوات التحالف13،14. حبيس نمت في واجهة الهواء السائل (على) تسمح للتقدير الكمي CFTR الفنية مباشرة من خلال اختبار الكهربية أو غير مباشر من خلال تدابير ASL التوازن13،15. هذا النموذج كان حاسما في فهم بيولوجيا CFTR ومحركاً أساسيا في تنمية CFTR المغيرون16. ولسوء الحظ، نماذج HBE لا يمكن تحصيلهما كنموذج شخصية بسبب طبيعة الغازية اقتناء (زرع الرئة أو الشعب الهوائية بالفرشاة) وعدم وجود نماذج لأولئك مع الطفرات النادرة أو مرض خفيف. على العكس من ذلك، يمكن استخدام الأنسجة المعوية، التي تم الحصول عليها من عينات خزعة المستقيم أو الإثني عشر، للقياس الحالي المعوية (ICM) أو الإنزيم أورجانويد المستندة إلى تورم دراسة فردية CFTR الدالة17،18، 19-فحوصات أورجانويد، على وجه الخصوص، نماذج حساسة جداً CFTR النشاط20،،من21إلى22. كلا النموذجين محدودة من المصدر الأنسجة (الأنسجة المعوية، بينما معظم الأمراض أمراض الجهاز التنفسي) والأسلوب شبه الغازية لاقتناء. وبدلاً من ذلك، درسنا العديد من المحققين البشرية الآنف الخلايا الظهارية (هني) إلى نموذج CFTR استعادة23،،من2425. الاهناسى يمكن أن تحصد بأمان بالفرشاة أو الكشط في موضوعات في أي سن، والخص عندما مثقف في على العديد من خصائص حبيس25،26،،من2728. تقليديا كانت محدودة ثقافات أحادي الطبقة هني التحول صدفية ونضج29منذ وقت طويل. وعلاوة على ذلك، أفادت الدائرة القصيرة القياسات الحالية في الاهناسى أصغر من تلك التي في حبيس، مما يوحي بنافذة صغيرة للكشف عن الفعالية العلاجية25.
نظراً للحاجة لنموذج شخصي، وغير الغازية، والالتهاب الرئوي زراعة الأنسجة للدالة CFTR، سعينا إلى دمج حساسية مقايسة أورجانويد المستندة إلى تورم، مع الطابع غير الغازية والجهاز التنفسي الاهناسى. وهنا يصف لنا لدينا طريقة لتوليد الثقافات ثلاثي الأبعاد “كروي” الاهناسى للدراسة CFTR فردية في تحليل القائم على تورم30. الماغنيسيوم هني استقطاب وموثوق بها مع ذروة الظهارية نحو مركز المجال، أو التجويف. هذا النموذج يلخص خصائص عديدة ظهارة الجهاز التنفسي السفلي وينضج بسرعة أكبر على الثقافات. كتحليل وظيفية، كمياً الماغنيسيوم هني موثوق وظيفة مجموعة CFTR، فضلا عن التحوير في الطفرة مدروسة المجموعات (مثلاً، F508del CFTR). هذا التحليل يستند إلى تورم تستفيد من خصائص النقل أيون/الملح CFTR، غير مباشر قياس تدفق السوائل إلى كروي كما يلي قمي efflux الملح من المياه. في هذا الشكل، الماغنيسيوم حفزت مع CFTR تعمل بكامل طاقتها تضخم قوة، بينما تلك مع CFTR مختلة تضخم أقل أو تقليصها. هذا هو التحديد الكمي من خلال تحليل الصورة من قبل والماغنيسيوم التحفيز بعد ح 1، قياس المجال لومينال، وتحديد النسبة المئوية للتغيير. ويمكن مقارنة هذا التدبير ثم عبر المجموعات التجريبية للشاشة بيواكتيفيتي المخدرات بطريقة خاصة بالمريض.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويصف هذا البروتوكول توليد خلايا الآنف المستمدة من المريض كروي الثقافات قادرة على إنتاج نموذج فردي، ومحددة للدالة CFTR. وهناك العديد من الخطوات الرئيسية في العملية التي ينبغي أن يشارك عن كثب لتجنب صعوبة. الأول هو الحصول على عينة جيدة من آنف المريض. يجب أن يكون نموذج جيد > الخلايا 50,000، محدودة م…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل وأيده “المداواة مؤسسة التليف الكيسي”، منح رقم CLANCY14XX0، ومن خلال “مؤسسة التليف الكيسي”، منح رقم CLANCY15R0. الكتاب أود أن أشكر رأي كريستينا لمساعدتها في توظيف المريض والرقابة التنظيمية. الكتاب أيضا نود أن نشكر الفريق العامل هني، التي تدعمها “مؤسسة التليف الكيسي”، الذين ساعدوا في توليد قدرات الثقافة هني: “براتشر بريستون”، القطن كالفن، مارتينا جينتزش، إليزابيث جوسيلوف، ومايكل ميربورج، ديف نيكولز، راندل سكوت وروى ستيف وزاي-سليمان مارتي وتوجل كاثرين.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf Tube | USA Scientific | 4036-3204 | |
| 150 mL Filter Flask | Midsci | TP99150 | To filter Media |
| 15 mL Conical Tube | Midsci | TP91015 | |
| 1 L Filter Flask | Midsci | TP99950 | To filter Media |
| 35 mm Glass-Bottom Dish | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | Optional |
| 3-Isobutyl-1-Methylxanthine (IBMX) | Fisher Scientific | AC228420010 | Prepare a 100 mM stock solution of 22.0 mg in 1 mL of DMSO |
| 50 mL Conical Tube | Midsci | TP91050 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies, Inc. | AT-104 | Cell detachment solution |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786-25G | See Table 1 |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A9528-100MG | See Table 1 |
| Bovine Brain Extract (9mg/mL) | Lonza | CC-4098 | See Table 2 |
| Ceftazidime hydrate | Sigma-Aldrich | C3809-1G | See Table 1 |
| Cell Scrapers 20 cm | Midsci | TP99010 | |
| CFTR Inh172 | Tocris Bioscience | 3430 | Prepare a 10 mM stock solution of 4.0 mg in 1 mL of DMSO |
| Cholera Toxin B (From Vibrio cholerae) | Sigma-Aldrich | C8052-.5MG | See Table 1 |
| CYB-1 | Medical Packaging Corporation | CYB-1 | Cytology brush |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D5879-500ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12 Hepes | Life Technologies | 11330-057 | Base Medium; See Tables 1 and 2 |
| Epidermal Growth Factor (Recombinant Human Protein, Animal-Origin Free) | Thermo Fisher Scientific | PHG6045 | See Table 1 |
| Epinephrine | Sigma-Aldrich | E4250-1G | See Table 2 |
| Ethanol | Fisher Scientific | 2701 | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E0135-500ML | 16.6 mM solution; See Table 2 |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | TCI America | E0084 | |
| Fetal Bovine Serum (high performance FBS) | Invitrogen | 10082147 | See Table 1 |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886-50 | Prepare a 10 mM stock solution of 4.1 mg in 1 mL of DMSO |
| Growth Factor-Reduced Matrigel | Corning, Inc. | 356231 | Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free, 10 mL. |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Human Collagen Solution, Type I (VitroCol; 3 mg/mL) | Advanced BioMatrix | 5007-A | Collagen solution |
| HyClone (aka FetalClone II) | GE Healthcare | SH30066.03HI | See Table 2 |
| Hydrocortisone | StemCell Technologies | 07904 | See Tables 1 and 2 |
| Insulin, human recombinant, zinc solution | Life Technologies | 12585014 | 4 mg/mL solution; see Table 2 |
| IVF 4-Well Dish, Non-treated | NUNC (via Fisher Scientific) | 12566350 | 4-well plate for spheroids; similar well size to a 24-well plate |
| MEF-CF1-IRR | Globalstem | GSC-6001G | Irradiated murine embryonic fibroblasts |
| Metamorph 7.7 | Molecular Devices | Analysis Software; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software for a quote | |
| Olympus IX51 Inverted Microscope | Olympus Corporation | Discontinued | Imaging Microscope. Replacment: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/ for a quote |
| Pen Strep | Life Technologies | 15140122 | See Table 2 |
| Phsophoryletheanolamine | Sigma-Aldrich | P0503-5G | See Table 2 |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | See Table 2 |
| Rhinoprobe | Arlington Scientific, Inc. | 96-0905 | Nasal curette |
| Slidebook 5.5 | 3i, Intelligent Imaging Innovations | Discontinued | Imaging Software. Replacement: Slidebook 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook for a quote |
| Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | |
| Sterile Water | Sigma-Aldrich | W3500-6X500ML | |
| Tissue Culture Dish 100 | Techno Plastic Products | 93100 | Tissue culture dish for expansion |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014-100MG | See Table 1 |
| Transferrin (Human Transferrin 0.5 mL) | Lonza | CC-4205 | See Table 2 |
| Triiodothryonine | Sigma-Aldrich | T6397-1G | 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt [T3]; See Table 2 |
| Trypsin from Porcine Pancreas | Sigma-Aldrich | T4799-10G | |
| Ultroser-G | Crescent Chemical (via Fisher Scientific) | NC0393024 | 20 mL lypophilized powder; See Table 2 |
| Vancomycin hydrochloride from Streptomyces orientalis | Sigma-Aldrich | V2002-5G | See Table 1 |
| VX770 | Selleck Chemicals | S1144 | Prepare a 1 mM stock solution of 0.4 mg in 1 mL of DMSO |
| VX809 | Selleck Chemicals | S1565 | Purchase or prepare a 10 mM stock solution of 4.5 mg in 1 mL of DMSO |
| Y-27632 Dihydrochloride ROCK inhibitor | Enzo LifeSciences | ALX-270-333-M025 | See Table 1 |
References
- Rowe, S. M., Miller, S., Sorscher, E. J. Cystic fibrosis. N Engl J Med. 352 (19), 1992-2001 (2005).
- Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
- Anderson, M. P., et al. Nucleoside triphosphates are required to open the CFTR chloride channel. Cell. 67 (4), 775-784 (1991).
- Boucher, R. C. Human airway ion transport. Part one. Am J Respir Crit Care Med. 150 (1), 271-281 (1994).
- Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. Cystic fibrosis: an inherited disease affecting mucin-producing organs. Int J Biochem Cell Biol. 52, 136-145 (2014).
- Accurso, F. J., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. N Engl J Med. 363 (21), 1991-2003 (2010).
- De Boeck, K., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation. J Cyst Fibros. 13 (6), 674-680 (2014).
- Moss, R. B., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis who have an Arg117His-CFTR mutation: a double-blind, randomised controlled trial. Lancet Respir Med. 3 (7), 524-533 (2015).
- Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. , (2015).
- Brewington, J. J., McPhail, G. L., Clancy, J. P. Lumacaftor alone and combined with ivacaftor: preclinical and clinical trial experience of F508del CFTR correction. Expert Rev Respir Med. 10 (1), 5-17 (2016).
- . . CFTR2 Database. , (2017).
- Mou, H., Brazauskas, K., Rajagopal, J. Personalized medicine for cystic fibrosis: establishing human model systems. Pediatr Pulmonol. 50 Suppl 40, S14-S23 (2015).
- Randell, S. H., Fulcher, M. L., O’Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).
- Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells. In Vitro Cell Dev Biol. 24 (5), 420-428 (1988).
- Worthington, E. N., Tarran, R. Methods for ASL measurements and mucus transport rates in cell cultures. Methods Mol Biol. 742, 77-92 (2011).
- Van Goor, F., et al. Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18843-18848 (2011).
- Hug, M. J., Tummler, B. Intestinal current measurements to diagnose cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 3 Suppl 2, 157-158 (2004).
- van Barneveld, A., Stanke, F., Ballmann, M., Naim, H. Y., Tummler, B. Ex vivo biochemical analysis of CFTR in human rectal biopsies. Biochim Biophys Acta. 1762 (4), 393-397 (2006).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).
- Dekkers, J. F., et al. Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids. Eur Respir J. 48 (2), 451-458 (2016).
- Dekkers, R., et al. A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR modulators in human plasma. J Cyst Fibros. 14 (2), 178-181 (2015).
- Zomer-van Ommen, D. D., et al. Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids. J Cyst Fibros. , (2015).
- Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure. In Vitro Cell Dev Biol. 27a (9), 684-686 (1991).
- Di Lullo, A. M., et al. An "ex vivo model" contributing to the diagnosis and evaluation of new drugs in cystic fibrosis. Acta Otorhinolaryngol Ital. 37 (3), 207-213 (2017).
- Pranke, I. M., et al. Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators. Sci Rep. 7 (1), 7375 (2017).
- Devalia, J. L., Davies, R. J. Human nasal and bronchial epithelial cells in culture: an overview of their characteristics and function. Allergy Proc. 12 (2), 71-79 (1991).
- Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro. Respir Med. 84 (4), 303-312 (1990).
- Thavagnanam, S., et al. Nasal epithelial cells can act as a physiological surrogate for paediatric asthma studies. PLoS One. 9 (1), e85802 (2014).
- Jorissen, M., Van der Schueren, B., Van den Berghe, H., Cassiman, J. J. The preservation and regeneration of cilia on human nasal epithelial cells cultured in vitro. Arch Otorhinolaryngol. 246 (5), 308-314 (1989).
- Brewington, J. J., et al. Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids. J Cyst Fibros. , (2017).
- Sun, H., et al. Tgf-beta downregulation of distinct chloride channels in cystic fibrosis-affected epithelia. PLoS One. 9 (9), e106842 (2014).
- Boucher, R. C. Evidence for airway surface dehydration as the initiating event in CF airway disease. J Intern Med. 261 (1), 5-16 (2007).
