एक Ecdysone रिसेप्टर-मजबूती, Reversibility, और नगण्य Leakiness के साथ Transgene की जानबूझकर अभिव्यक्ति के लिए विलक्षण जीन स्विच आधारित
Summary
यहाँ, हम tebufenozide उपचार द्वारा pEUI (+) एकवचन जीन स्विच का उपयोग transgene अभिव्यक्ति का मॉडुलन के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद.
Abstract
transgene अभिव्यक्ति का सटीक नियंत्रण जैविक और नैदानिक अध्ययन में वांछनीय है । हालांकि, क्योंकि वर्तमान में कार्यरत जीन स्विच के द्विआधारी सुविधा दो चिकित्सीय अभिव्यक्ति इकाइयों के हस्तांतरण एक ही कक्ष में समवर्ती की आवश्यकता है, जीन थेरेपी के लिए प्रणाली के व्यावहारिक आवेदन सीमित है । transgene अभिव्यक्ति प्रणाली को सरल बनाने के लिए, हम एक जीन pEUI के रूप में निर्दिष्ट स्विच उत्पंन (+) transgene अभिव्यक्ति मॉड्यूल का एक पूरा सेट शामिल एक एकल सदिश में । GAL4 डीएनए के शामिल-बंधन डोमेन और संशोधित ईसीआर (GvEcR), एक ंयूनतम VP16 सक्रियकरण डोमेन एक GAL4 डीएनए के साथ जुड़े-बंधन डोमेन, साथ ही साथ एक संशोधित Drosophila ecdysone रिसेप्टर (ईसीआर), नव विकसित एकवचन जीन स्विच अत्यधिक है एक समय और खुराक पर निर्भर तरीके से एक रासायनिक उत्प्रेरण के प्रशासन के लिए उत्तरदायी. pEUI (+) वेक्टर दोनों जैविक अनुसंधान और पूर्व नैदानिक अध्ययन में transgene अभिव्यक्ति के नियंत्रण में सुधार के लिए एक संभावित शक्तिशाली उपकरण है । यहाँ, हम tebufenozide (Teb) के उपचार के द्वारा वेक्टर pEUI (+) का उपयोग कर एक क्षणिक और स्थिर transgene अभिव्यक्ति के मॉडुलन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इसके अतिरिक्त, हम एक रासायनिक उत्प्रेरण के रूप में Teb के उपयोग के लिए महत्वपूर्ण दिशानिर्देश साझा करते हैं ।
Introduction
कई विभिंन जीन स्विचेस को ठीक सेल संस्कृति और पशु मॉडल में transgene अभिव्यक्ति को विनियमित करने की क्षमता के लिए पता लगाया गया है, सफलता1,2,3की डिग्री बदलती के साथ । संभावित जीन स्विच सिस्टम सहित कई कड़े मानदंडों को पूरा करना चाहिए,: transgene, खुराक के सटीक दिशात्मक अभिव्यक्ति और उत्प्रेरणों के लिए समय पर निर्भर जवाबदेही, प्रमोटर की नगण्य leakiness, transgene के reversibility उत्प्रेरण हटाने के माध्यम से सक्रियण, और सेल लाइनों और प्रयोगशाला जानवरों1,2,3के लिए संतोषजनक विषाक्तता का स्तर । टेट्रासाइक्लिन4,5, rapamycin6,7,8, mifepristone9,10, सहित कई छोटे अणु उत्प्रेरणों का शोषण किया गया है, और ecdysone11,12,13,14. सामान्य तौर पर, इन प्रणालियों दो या तीन असतत अभिव्यक्ति इकाइयों, जिनमें से एक या दो जिनमें से एक विनियामक तत्व (उत्प्रेरण प्लाज्मिड) है कि एक छोटे से अणु उत्प्रेरण transcriptional गतिविधि हासिल करने के लिए बांध के साथ दो plasmids की आवश्यकता होती है; और एक अंय प्लाज्मिड (प्रभाव प्लाज्मिड) एक विनियामक डीएनए क्षेत्र है कि उत्प्रेरण-बाध्य विनियामक तत्व के उपयोग की अनुमति देता है के नियंत्रण में युक्त transgene । द्विआधारी प्रणाली के मुख्य दोष यह है कि यह दो वैक्टर के सहवर्ती परिचय (उत्प्रेरण और प्रभाव) लक्ष्य कक्ष में की आवश्यकता है । क्षणिक transgene अभिव्यक्ति प्रयोगों में, दो plasmids के एक साथ अभिकर्मक अनिवार्य रूप से कोशिकाओं है कि अकेले या तो उत्प्रेरण या प्रभाव, या सह transfected असमान के साथ transfected है की आबादी पैदा करता है । इसके अतिरिक्त, बाइनरी प्रणाली में स्थिर कोशिका रेखाएं स्थापित करने के लिए एंटीबायोटिक के चयन के कम से दो दौर की आवश्यकता होती है, जो कि समय लेने वाली और श्रमसाध्य है । इस प्रकार, एक सदिश में transgene अभिव्यक्ति और विनियमन के लिए आवश्यक घटकों के सभी संयोजन एक ही कक्ष में सभी आवश्यक तत्वों की सहवर्ती अभिव्यक्ति की गारंटी और transgene अभिव्यक्ति के विनियमन के लिए अनुमति देने के लिए आदर्श होगा छोटे अणु उत्प्रेरण के साथ उपचार के माध्यम से ।
बाइनरी जीन स्विच की कमियों को दूर करने के लिए हमने हाल ही में एक विलक्षण जीन स्विच विकसित किया, जिसका उपयोग एक Drosophila melanogaster ईसीआर आधारित जीन inducible प्रणाली15ने किया । Ecdysone मध्यस्थता जीन अभिव्यक्ति जब यह ईसीआर/ultraspiracle (खासियत) heterodimer है, जो बारी में डीएनए विनियामक तत्वों के लिए ईसीआर के बंधन में लाती है3,11के लिए बाइंड कर देता है । हड्डीवाला रेटिनॉइड एक्स रिसेप्टर (RXR), कीट खासियत की एक ortholog, रंगरूटों ईसीआर एक सक्रिय transcriptional उत्प्रेरक16बनाने के लिए । इस प्रकार, हड्डीवाला कोशिकाओं या ऊतक, ईसीआर और RXR में एक transgene के लक्षित अभिव्यक्ति के लिए सह होना चाहिए पहले एक साथ व्यक्त ecdysone या उसके एगोनिस्ट द्वारा उत्तेजित किया जा रहा है । ईसीआर-आधारित जीन स्विच की heterodimeric सुविधा के बाद से अंतर्जात RXR स्तर, Padidam एट अलसे प्रभावित किया जा सकता है । ईसीआर डीएनए की जगह-heterologous GAL4 डीएनए के साथ बाध्यकारी और सक्रियकरण डोमेन-बाध्यकारी, दाद सिंप्लेक्स वायरस प्रोटीन vmw65 (VP16) सक्रियकरण डोमेन ईसीआर ligand-बाध्यकारी डोमेन है, जो तो अंतर्जात RXR को निष्क्रिय हो गया और एक homodimer का गठन करने के लिए जुड़े transcriptional गतिविधि हासिल करने के लिए17. ईसीआर आधारित जीन स्विच और एक chimeric ंयूनतम VP16 सक्रियण GvEcR, जो एक homodimer और cytosol ecdysone, एगोनिस्ट16के अभाव में Teb में स्थानीयकृत गठन के साथ संयुक्त डोमेन के शामिल प्रोटीन के निर्माण से सुधार हुआ था, 18. Teb के लिए बाध्य करके, GvEcR नाभिक को cytosol से अपने उपसेलुलर स्थानीयकरण बदल एक संकर zebrafish E1b ंयूनतम प्रमोटर के शामिल एक दस मिलकर दोहराया ऊपर सक्रियकरण अनुक्रम (UASs) के साथ संयुक्त प्रमोटर को पहचानने के लिए शुरू लक्ष्य जीन की प्रतिलेखन16।
के लिए पहले रिपोर्ट ईसीआर आधारित सरल जीन स्विचेस16,18, हम एक एकल वेक्टर में transgene अभिव्यक्ति उत्तेजक के लिए सभी आवश्यक तत्वों के साथ सुसज्जित है, और फिर नामित प्रणाली के द्विआधारी सुविधाओं संयुक्त नव निर्मित वेक्टर, pEUI (+) (GenBank प्रवेश संख्या: KP123436, चित्र 1a)15। GvEcR चालक (इसके बाद चालक) को जवाब देने के प्रभाव दस मिलकर यूएएस एक E1b ंयूनतम प्रमोटर के बाद एक बहु क्लोनिंग साइट (MCS) के साथ EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI, और AflII मांयता दृश्यों के लिए अगले दोहराता है (चित्र 1b) । इसके अतिरिक्त, transfected कोशिकाओं के चयन की सुविधा के लिए, एक SV40 प्रमोटर चालित puromycin एन-एसिटाइल-ट्रांस्फ़्रेज़ (पीएसी) जीन चालक और प्रभाव क्षेत्रों के बीच स्थिर सेल लाइनों (चित्रा 1) बनाए रखने के लिए रखा गया था ।
हम pEUI (+) का उपयोग कर transgene अभिव्यक्ति के क्षणिक और स्थिर मॉडुलन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन । इसके अलावा, हम एक ecdysone एगोनिस्ट के रूप में Teb के सफल प्रयोग के लिए विस्तृत निर्देश प्रदान करते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक द्विआधारी जीन अभिव्यक्ति स्विच का उपयोग कर के मुख्य दोष एक साथ लक्ष्य कक्ष में दो अलग plasmids (चालक और प्रभाव) देने की जरूरत है । यह plasmids के एक असमान वितरण करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और स्विच के एक असंगत ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक एस वाई चोई (Chonnam राष्ट्रीय विश्वविद्यालय) बहुमूल्य टिप्पणियां और हमारी पांडुलिपि के गहन पढ़ने के लिए धंयवाद । इस काम को Chungnam नेशनल यूनिवर्सिटी के एक रिसर्च फंड ने सपोर्ट किया था ।
Materials
| pEUI(+) | TransLab | The patent license was transferred to TransLab Inc. | |
| Gene-Fect Transfection Reagent | TransLab | TLC-001 | |
| HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Tebufenozide | Fluka | 31652 | |
| Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
| Puromycin | Corning | 58-58-2 | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA | Welgene | LS015-01 | |
| DMEM | Welgene | LM001-05 | |
| Fetal Bovine Serum | Welgene | S001-01 | |
| Cell culture dish | SPL life science | 11090 | |
| mouse FLAG M2 | Sigma | F3165 | |
| anti-alpha tubulin antibody | Calbiochem | CP06 | |
| Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410.1 | |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent |
Thermo Fisher | 78505 | |
| 100X Protease inhibitor Cock. III | T&I | BPI-9200 |
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