Ecdysone 수용 체 기반 단일 유전자 스위치 견고성, 가역, 및 무시할 수 시키는 Transgene의 의도적인 표현에 대 한
Summary
여기, 선물이 transgene 식 tebufenozide 치료에 의해 pEUI(+) 단일 유전자 스위치를 사용 하 여 변조에 대 한 프로토콜.
Abstract
Transgene 식의 정확한 제어 생물 학적 및 임상 연구에 바람직합니다. 그러나, 현재 고용된 유전자 스위치의 바이너리 기능을 단일 셀으로 두 치료 식 단위 전송 동시에 사용 하려면, 때문에 유전자 치료에 대 한 시스템의 실용적인 응용 프로그램 제한 됩니다. Transgene 식 시스템을 단순화 하기 위해 단일 벡터의 transgene 식 모듈의 완전 한 세트를 포함 하는 pEUI(+)로 지정 하는 유전자 스위치를 생성 했습니다. 새로 개발된 된 단일 유전자 스위치 높은 GAL4 DNA 바인딩 도메인의 구성 및 수정된 EcR (GvEcR), 최소 VP16 활성화 도메인 GAL4 DNA 바인딩 도메인 (EcR), 수정 된 초파리 ecdysone 수용 체와 융합 시간 복용량에 따라 방식으로 화학 유도의 관리에 응답. PEUI(+) 벡터는 transgene 식 생물 학적 연구와 전 임상 연구에서의 제어를 향상 시키기 위한 잠재적으로 강력한 도구입니다. 여기, 우리 tebufenozide (Teb)의 치료에 의해 pEUI(+) 벡터를 사용 하는 과도 하 고 안정적인 transgene 식의 변조에 대 한 상세한 프로토콜을 제시. 또한, 우리는 화학 유도로 Teb의 사용에 대 한 중요 한 지침을 공유합니다.
Introduction
여러 다른 유전자 스위치는 transgene 식 세포 배양 및 동물 모델, 성공1,2,3의 다양 한 각도 정확 하 게 조절 하는 능력에 대 한 탐험 되었습니다. 잠재적인 유전자 스위치 시스템 등 몇 가지 엄격한 기준을 충족 해야: transgene, inducers, 발기인의 무시할 수 시키는, 가역 transgene의 복용량 및 시간에 따른 응답의 정확한 방향 표현 유도 제거, 및 유도 독성 레벨 셀 라인을 실험실 동물1,2,3쾌활 통해 활성화. 항생물질4,5, rapamycin6,7,8, mifepristone9,10를 포함 하 여 몇 가지 작은 분자 inducers 악용 되어 그리고 ecdysone11,12,,1314. 일반적으로 이러한 시스템 2 개 또는 3 개의 개별 식 단위를 포함 하는 두 개 이상의 플라스 미드, 하나 또는 두 작성 transcriptional 활동을 얻기 위해 작은 분자 유도 규제 요소 (유도 플라스 미드) 그리고 또 다른 플라스 미드 (effector 플라스 미드) 유도 바인딩된 규제 요소에의 액세스를 허용 하는 규제 DNA 영역 통제 transgene를 포함. 이진 시스템의 주요 단점은 대상 셀에 두 개의 벡터 (유도 및 effector)의 수 반하는 도입 필요. 과도 transgene 식 실험에서 두 개의 플라스 미드의 동시 transfection 필연적으로 생산 하지는 유도 또는 이펙터, 페 단독 또는 공동 하지 똑같이 페 셀의 인구. 또한, 이진 시스템 2 라운드는 어렵고 힘 드는 안정 세포 선 확립 항생제 선택의 필요 합니다. 따라서, transgene 식에 필요한 모든 구성 요소를 결합 하 고 단일 벡터에 규제의 단일 셀의 모든 필수 요소 부수적인 표현 보장 transgene 표현의 규제에 대 한 허용을 이상적인 것 통해 작은 분자 inducers와 치료.
이진 진 스위치의 단점을 극복 하기 위해 우리 최근 개발 단 수 유전자 스위치는 초파리 melanogaster EcR 기반 유전자 유도할 수 있는 시스템15를 사용 하 여. Ecdysone 중재 유전자 발현 DNA 규제 요소3,11EcR의 바인딩 차례로 유도 EcR/ultraspiracle (USP) heterodimer를 묶을 때. 척 추가 있는 retinoid X 수용 체 (RXR), 곤충, USP의 ortholog EcR 활성 transcriptional 활성 제16를 보충 한다. 따라서, 척추 세포 또는 조직에 있는 transgene의 타겟된 식 EcR과 RXR 해야 공동 표현한 동시에 ecdysone 또는 그 촉진제에 의해 자극 되 고 전에. 때문에 EcR 기반 유전자 스위치의 heterodimeric 기능 생 RXR 수준, Padidam 외에의해 영향을 받을 수 있습니다. EcR DNA 바인딩 및 활성화 도메인 분리 GAL4 DNA 바인딩, 포진 심 플렉스 바이러스 단백질 vmw65 교체 (VP16) 활성화 도메인 다음 생 RXR 응답 되었고 한 homodimer 형성 EcR의 ligand 바인딩 도메인에 융합 에 transcriptional 활동17를 얻을. EcR 기반 유전자 스위치는 homodimer 형성 ecdysone 주 작동 근, Teb16의 부재에 cytosol에는 GvEcR와 함께 최소한의 VP16 활성화 도메인의 구성 공상 단백질을 구성 하 여 더욱 향상 되었다 18. Teb에 바인딩하여는 GvEcR 변경의 subcellular 지 방화는 cytosol에서 핵 zebrafish E1b 10 탠덤와 함께 최소한의 발기인의 구성 하이브리드 발기인 반복 상류 활성화 순서 (UASs) 시작을 인식 하는 16대상 유전자의 전사
16,18전환 이전에 보고 된 EcR 기반 유전자를 단순화 하기 위해, 우리는 자극 transgene 식에 대 한 모든 필수 요소를 갖춘 다음 지정 된 단일 벡터에 결합 시스템의 바이너리 기능 새로 생성 된 벡터, pEUI(+) (은행 승인 번호: KP123436, 그림 1A)15. GvEcR 드라이버 (이 드라이버)에 응답 하는 이펙터 EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI, 및 AflII 인식 시퀀스 (그림 1B) 10 탠덤 UAS E1b 최소한의 발기인을 여러 복제 사이트 (MCS)에 의해 다음 다음 반복 구성 됩니다. 페의 선택을 촉진 하는 또한, 세포는 SV40 발기인 기반 puromycin N-아 세 틸-안정적인 셀 라인 (그림 1)를 유지 하기 위해 드라이버와 이펙터 영역 사이 전이 (PAC) 효소 유전자 배치 했다.
우리는 transgene 식 pEUI(+)를 사용 하 여의 과도 하 고 안정적인 변조에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 또한, 우리는 ecdysone 주 작동 근으로 Teb의 성공적인 사용에 대 한 자세한 지침을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이진 진 식 스위치를 사용 하 여의 주요 단점은 동시에 대상 셀에 두 개의 별도 플라스 미드 (드라이버 및 이펙터)를 제공 하는 필요. 이 플라스 미드와 inducers,12,3스위치의 일관성이 응답에서 결과의 부동 한 배급을 이어질 수 있습니다. 두 벡터 시스템의 또 다른 단점은 항생제 선택의 2 라운드의 최소 유망한 셀 라인을 식별 하…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 소중한 의견 및 우리의 원고의 철저 한 독서에 대 한 S Y 최 (전남 대학교) 감사합니다. 이 작품은 충남 대학교의 연구 기금에 의해 지원 되었다.
Materials
| pEUI(+) | TransLab | The patent license was transferred to TransLab Inc. | |
| Gene-Fect Transfection Reagent | TransLab | TLC-001 | |
| HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Tebufenozide | Fluka | 31652 | |
| Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
| Puromycin | Corning | 58-58-2 | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA | Welgene | LS015-01 | |
| DMEM | Welgene | LM001-05 | |
| Fetal Bovine Serum | Welgene | S001-01 | |
| Cell culture dish | SPL life science | 11090 | |
| mouse FLAG M2 | Sigma | F3165 | |
| anti-alpha tubulin antibody | Calbiochem | CP06 | |
| Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410.1 | |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent |
Thermo Fisher | 78505 | |
| 100X Protease inhibitor Cock. III | T&I | BPI-9200 |
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