脱皮ホルモン受容体を介した特異遺伝子スイッチ意図的な堅牢性、可逆性、ごくわずかな水漏れしたためと遺伝子発現の
Summary
ここでは、テブフェノジド処理による pEUI(+) 特異遺伝子スイッチを用いた遺伝子発現の調節のためのプロトコルを提案する.
Abstract
遺伝子発現の精密制御が望ましい生物学的および臨床的研究です。ただし、現在失業遺伝子スイッチのバイナリの機能は、単一のセルに同時に 2 つの治療式単位の転送を必要とするため、遺伝子治療のためのシステムの実用的なアプリケーションが制限されます。遺伝子組み換え式システムを簡素化し、1 つのベクトルで遺伝子発現モジュールの完全なセットを包括的な pEUI(+) として示される遺伝子スイッチを生成されます。新開発の特異遺伝子のスイッチは非常に GAL4 DNA 結合ドメインの構成と変更された EcR (GvEcR)、変更されたショウジョウバエ脱皮ホルモン受容体 (EcR) と同様、GAL4 DNA 結合ドメインと融合した最小限 VP16 活性化ドメイン時間と用量依存的に化学インデューサの管理に対応。PEUI(+) ベクターは、生物学的研究と前臨床研究遺伝子発現の制御を改善するための強力なツールです。ここでは、変調テブフェノジド (Teb) 処理による pEUI(+) ベクトルを用いた非定常かつ安定的な発現のための詳しいプロトコルを提案する.また、Teb の化学誘導としての使用に関する重要なガイドラインを紹介します。
Introduction
いくつかの異なる遺伝子のスイッチは、正確に遺伝子発現細胞培養および動物モデル、成功1,2,3の度合いを調節する能力について検討しています。潜在的な遺伝子のスイッチ システムを含む、いくつかの厳格な条件を満たす必要があります: 遺伝子、誘導、プロモーターのごくわずかな水漏れしたため、transgene の可逆性の用量と時間依存応答性の正確な方向式インデューサの除去や細胞および研究室動物1,2,3に許容インデューサ毒性レベルを介して活性化。テトラサイクリン4、5ラパマイシン6,7、8ミフェプリストン9,10を含むいくつかの小分子誘導を悪用されています。エクダイソン11,12,13,14。一般に、これらのシステムは、2 つまたは 3 つの離散式ユニットを含む、少なくとも 2 つのプラスミドを必要とする、1 つまたは 2 つの構成; 転写活性を得るために小分子インデューサをバインド規制要素 (インデューサ プラスミッド)別プラスミド (エフェクター プラスミッド) インデューサ バインド規制要素へのアクセスを可能にする規制 DNA 領域の制御の下で遺伝子を含みます。バイナリ システムの主な欠点は、ターゲット セル (インデューサとエフェクター) 2 つのベクトルの併用導入を必要とすることです。一時的な遺伝子発現実験の 2 種のプラスミドの同時トランスフェクション必然的を生成する単独でインデューサか、エフェクターをトランスフェクトしたまたは co transfected ない均等にするセルの人口。さらに、バイナリ システムでは、時間がかかり、骨の折れるである安定したセルラインを確立する抗生物質選択の少なくとも 2 つのラウンドが必要です。したがって、遺伝子発現に必要なすべてのコンポーネントを組み合わせることと 1 つのベクトルに規制が単一のセルにすべての必要な要素の随伴表現を保証し、遺伝子発現の調節を可能にする理想的だろう小分子誘導と治療を通じて
バイナリの遺伝子スイッチの欠点を克服するためには、キイロショウジョウバエEcR 遺伝子誘導システム15を使用して特異遺伝子スイッチ我々 最近開発。エクジソンは、順番 DNA 規制要素3,11EcR のバインディングを誘導する EcR/ウルトラスピラクル (USP) ヘテロダイマーにバインドするときに遺伝子発現を仲介します。脊椎動物のレチノイド X 受容体 (RXR)、昆虫、USP のオーソログがアクティブな転写活性化因子16を形成する EcR を募集します。したがって、脊椎動物の細胞または組織の遺伝子発現のターゲット、EcR と RXR 必要があります共発現同時に脱皮ホルモンまたはそのアゴニストによって刺激されて前に。以来、EcR 遺伝子スイッチのヘテロ二量体の機能は、内因性の RXR レベル、Padidamらによって影響があります。異種 GAL4 DNA 結合、単純ヘルペス ウイルス蛋白質 vmw65 置き換え EcR DNA 結合と活性化ドメイン (VP16) 活性化ドメイン融合内因性 RXR に応答しなくなったし、ホモを形成した EcR リガンド結合ドメイン転写活性17を得よう。EcR ベース遺伝子のスイッチは、ホモを形成し、エクジソン アゴニスト、Teb16のない状態で細胞質に局在 GvEcR と組み合わせて最小限 VP16 活性化ドメインから成るキメラ蛋白質を構築することでさらに改善されました。 18。Teb にバインディングによって、GvEcR、内局細胞質からに変更ゼブラフィッシュ E1b 10 タンデム併用最小プロモーターから成るハイブリッド プロモーターの反復上流活性化配列 (UASs) を開始するを認識する核、16ターゲット遺伝子のトランスクリプション。
以前に報告した EcR 遺伝子を簡素化するスイッチ16,18、刺激的な発現のためすべての必要な要素を装備し、指定の単一ベクトルにシステムのバイナリの機能を結合我々新しく生成されたベクトル pEUI(+) (GenBank 受入番号: KP123436、図 1 a)15。EcoRI、PmlI、NheI、BmtI、AfeI、および AflII の認識シーケンスが (図 1 b) UAS を繰り返す多重クローニング サイト (MCS) 続いて E1b 最小プロモーターの横にある 10 のタンデムのエフェクター GvEcR ドライバー (ドライバー以下) への応答で構成されます。選択を容易にするためにさらに、トランスフェクション細胞の SV40 プロモーターに駆動されるピューロマイシンN-アセチルのトランスフェラーゼ (PAC) 遺伝子は安定したセルライン (図 1) を維持するためにドライバーとエフェクターの間置かれました。
PEUI(+) を用いた遺伝子発現の非定常かつ安定的な変調のための詳しいプロトコルについて述べる。また、脱皮ホルモンのアゴニストとして Teb の正しく使用するための詳細な手順を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
バイナリの遺伝子発現のスイッチを使用しての主な欠点は同時に目的セルに 2 つの独立したプラスミド (ドライバーとエフェクター) を提供する必要があります。これはプラスミドと誘導1,2,3スイッチの矛盾した応答の結果の不平等な配分につながることができます。2 ベクター システムの別の欠点は、抗生物質の選択の 2 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、貴重なコメントや原稿の徹底的な読み込みのため S Y チェ (大学校) をありがとうございます。この作品は、忠南大学校の研究基金によって支えられました。
Materials
| pEUI(+) | TransLab | The patent license was transferred to TransLab Inc. | |
| Gene-Fect Transfection Reagent | TransLab | TLC-001 | |
| HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Tebufenozide | Fluka | 31652 | |
| Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
| Puromycin | Corning | 58-58-2 | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA | Welgene | LS015-01 | |
| DMEM | Welgene | LM001-05 | |
| Fetal Bovine Serum | Welgene | S001-01 | |
| Cell culture dish | SPL life science | 11090 | |
| mouse FLAG M2 | Sigma | F3165 | |
| anti-alpha tubulin antibody | Calbiochem | CP06 | |
| Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410.1 | |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent |
Thermo Fisher | 78505 | |
| 100X Protease inhibitor Cock. III | T&I | BPI-9200 |
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