Method Article

Ex Vivoラット脳切片を用いた神経変性疾患の主要なイベントを勉強する方法

DOI:

10.3791/57507

⸱

April 11th, 2018

 ,  , 
1Neuro-Bio Ltd, Building F5, Culham Science Centre

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

体内と体外の実験の利点を組み合わせてさらに神経変性疾患の基になる初期のイベントに対する洞察を提供することができますし、確立されたex vivo脳法に基づく手法を提案します。また、同じ解剖学的平面の処理と未処理のグループの直接の比較のためのユニークな機会を表します。

Abstract

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基になる神経変性を処理するプライマリを反映して信頼性の高いモデル動物の開発を試みる多くの研究にもかかわらずいくつかの非常に幅広く受け入れられてまいりました。ここでは、新しいプロシージャをよく知られている前のヴィヴォ脳スライス テクニックから、近い体内適応を提案する-として細胞の変性をトリガーする初期のイベントを調査するための体外の準備よりシナリオのようなアルツハイマー病 (AD) で観測されました。このバリエーションは、シンプルで簡単に再現できる手順を実行し、選択した脳の領域と、ローカル機能を生理学的環境での解剖学的研究の保存を有効にするで構成されています。別の解剖学的領域は、サイト、線量、および時間依存的で問題の治療法と複数の実験を実行する機会を提供すること、同じ脳から入手できます。この方法論に関連する成果に影響を与えることができる潜在的な制限を組織、すなわち、スライスとインキュベーションのステップおよび切片厚中の解剖学的な整合性の維持保全に関連します。生化学的および免疫組織化学的解析に影響を与えることができます。このアプローチは、生理学的または病理学的条件、薬物スクリーニング、または用量反応アッセイに関与する分子機構の探索など、さまざまな目的に流用できます。最後に、このプロトコルはまた動物行動学で採用数を減らすことができます。ここで報告されたアプリケーションが最近説明し、含む、前脳基底部 (BF)、広告で主に影響を受ける脳の領域の一つであるラット脳スライス前のヴィヴォの最初の時間のためにテストします。具体的には、それはアセチルコリンエステラーゼ (AChE) の C 末端から派生した有毒ペプチド投与がトリガー、BF の前後軸に沿った発現の広告のようなプロファイルを求める可能性が実証されています。alpha7 ニコチン性受容体 (α 7-nAChR) など、広告の変更蛋白質は、タウ (p-タウ) とアミロイド β (a β) にリン酸化。

Introduction

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広告は (OB)1,2,3、嗅 (EC)、BF、海馬 (HC)、嗅球などの異なった頭脳区域に影響を与える段階的な神経変性障害によって特徴づけられる慢性的な病理 4,5。広告開発の後期の段階は、この病気の約すべての場合6の 70% を占め、認知症の最も一般的なフォームを作り、進行性認知機能の低下に します。初期 AD の原因を理解する広範な試みにもかかわらずない現在、定義された実験的徴候がそれらを解明です。AD の病態も効果的な7,8 を証明している医薬品のターゲットを説明する完全なプロフィールを提供されていないまた、最も人気のある理論 -「アミロイド仮説」- は問わ ,9。

注目されている代替理論神経変性時に発生する初期のメカニズム広告3,

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Protocol

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すべての動物の研究は、承認されたプロトコルの下で行われています。

注: このセクションで実験プロシージャの間に実行される一連の主なフェーズと推奨される時間間隔が表示される (図 1)。また、プロトコルの説明は脳除去から潜伏期間 (図 2) 後の組織の均質化に至るまで重要なアクションを見せて、説明パネルによって補われます。材料と装置と WB 解析のため後続のフェーズを構築する手順について詳細は、前述の22です。

1. 手術器具、Vibratome 設定と治療準備

注: は、実験の手順を開始する前に次の手順を実行します。

  1. 2 つ異なる人工髄液 (aCSFs)、脳をスライスするために使用される 1 つを準備し、29が前述に潜伏ステップのための他。簡単に言えば、2 つの aCSFs の (モル) で働く集中は、「スライス」アプライド: 120 塩化ナトリウム、5 KCl、20 NaHCO3、2.4 CaCl2、2 MgSO4、1.2 KH2PO4....

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Results

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ここで提示されたプロトコルは、α 7-nAChR、p の式のサイト依存的に有毒ペプチド、T30 の管理が変調を示します-タウ ・ BF 含むセクション (図 3 a) で a β。ニコチン性受容体と比べてそのコントロール、吻側治療 hemislice の大幅な増加を示しています (スライス 1、 p = 0.0310) (図 3 b)、中間のスライスは 2 つの条件 (変更を明らかにしない中スライス 2、 p = 0.1195) (図 3 b)。後部セクションはそのコントロール側で大幅な削減は T30 露出部分に存在 (スライス 3、 p = 0.0476) (図 3 b)。T30 申請 p タウ レベルが大幅に側に一致するコントロールに対して前歯で増加 (スライス 1、 p.......

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Discussion

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特定のアプリケーションの後の彼らの応答を監視、同じ解剖学的面から取得した 2 つの鏡面 hemislices を同期的にテストすることができます確立前のヴィヴォ脳の技術に基づいて、このプロトコルの主要側面条件 (制御または扱われる);したがって、できるだけしっかりと制御実験パラダイムを提供します。神経変性イベント22日中に見られるように時間、線量 - と部位特異的異なる neurochemicals 神経障害に関連する評価の可能性は、本質的な機能を表します。この方法論は、体外で準備、関心領域を取得し、理想的な細胞外コンテキストの作成で精度などの体内の生理環境の利点をリンクします。このプロトコルは広く前のヴィヴォ電気生理学的記録25,26,27光イメージング28,プロ.......

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Disclosures

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著者は、競合する金銭的な利益を宣言します。スーザン ・ a. グリーン フィールドは、創設者兼社長神経バイオ限定、個人所有の会社と会社の株を保有しております。エマヌエーレ ブライとアントネラ Cogoni 神経バイオ株式会社の従業員であります。

Acknowledgements

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この作品会社ニューロ バイオで賄われていた我々 感謝したい博士・ ジョヴァンニ ・ Ferrati、博士セルジオ ・ ロトンド (神経生物)、コメントや原稿にアドバイスを。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
塩化ナトリウム(NaCl)Sigma-Aldrich, ドイツS7653aCSF調製用試薬
塩化カリウム(KCl)Sigma-Aldrich, ドイツP9333aCSF調製用試薬
重炭酸ナトリウム(NaHCO3)Sigma-Aldrich, ドイツS5761aCSF調製用試薬
硫酸マグネシウム七水和物(MgSO4 (7H2O))Sigma-Aldrich, ドイツ63138aCSF調製用試薬
リン酸カリウム一塩基性(KH2PO4)Sigma-Aldrich(ドイツP5655aCSF調製用試薬
Hepes塩Sigma-Aldrich(ドイツ) H7006aCSF調製用試薬
Hepes酸Sigma-Aldrich(ドイツH3375aCSF調製用試薬
Glucose Sigma-Aldrich(ドイツ)G7528aCSF調製用試薬
塩化カルシウム脱水Sigma-Aldrich, Germany223506aCSF調製用試薬
T30ペプチドGenosphere Biotechnologies, FranceAChE由来ペプチド試験
外科解剖キットWorld Precision Instruments, USAItem #: MOUSEKIT脳除去ステップ
外科用ブレードスワン・モートン、英国BS 2982脳除去ステップ
濾紙フィッシャー・サイエンティフィック、米国11566873スライスのための脳の準備
接着剤のための脳の準備
ビブラートーム・ライカ、ドイツVT1000 Sスライス
ブラシティッシュハンドリング
酸素ボンベ切片化およびインキュベーション段階
1x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)Fisher Scientific, USABP2438-4均質化ステップ
ホスファターゼ阻害剤Fisher Scientific, USA1284-1650均質化ステップ
プロテアーゼ阻害剤Roche complete PIC, USA4693116001均質化ステップ
PestlesStarlab, UKI1415-5390均質化ステップ
微量遠心分離機
Pierce 660 nm Protein AssayThermo Scientific, USA22660タンパク質濃度
) ) 物 済み スライス

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathologica. 82 (4), 239-259 (1991).
  2. Schliebs, R. Basal forebrain cholinergic dysfunction in Alzheimer's diseas....

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Ex Vivo Brain SlicesNeurodegeneration StudyRat Brain SlicesBrain SectioningHemislice PreparationArtificial Cerebrospinal FluidVibratome SectioningTissue HomogenizationWestern Blot AnalysisImmunohistochemical Analysis

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