Ex Vivoラット脳切片を用いた神経変性疾患の主要なイベントを勉強する方法
Summary
体内と体外の実験の利点を組み合わせてさらに神経変性疾患の基になる初期のイベントに対する洞察を提供することができますし、確立されたex vivo脳法に基づく手法を提案します。また、同じ解剖学的平面の処理と未処理のグループの直接の比較のためのユニークな機会を表します。
Abstract
基になる神経変性を処理するプライマリを反映して信頼性の高いモデル動物の開発を試みる多くの研究にもかかわらずいくつかの非常に幅広く受け入れられてまいりました。ここでは、新しいプロシージャをよく知られている前のヴィヴォ脳スライス テクニックから、近い体内適応を提案する-として細胞の変性をトリガーする初期のイベントを調査するための体外の準備よりシナリオのようなアルツハイマー病 (AD) で観測されました。このバリエーションは、シンプルで簡単に再現できる手順を実行し、選択した脳の領域と、ローカル機能を生理学的環境での解剖学的研究の保存を有効にするで構成されています。別の解剖学的領域は、サイト、線量、および時間依存的で問題の治療法と複数の実験を実行する機会を提供すること、同じ脳から入手できます。この方法論に関連する成果に影響を与えることができる潜在的な制限を組織、すなわち、スライスとインキュベーションのステップおよび切片厚中の解剖学的な整合性の維持保全に関連します。生化学的および免疫組織化学的解析に影響を与えることができます。このアプローチは、生理学的または病理学的条件、薬物スクリーニング、または用量反応アッセイに関与する分子機構の探索など、さまざまな目的に流用できます。最後に、このプロトコルはまた動物行動学で採用数を減らすことができます。ここで報告されたアプリケーションが最近説明し、含む、前脳基底部 (BF)、広告で主に影響を受ける脳の領域の一つであるラット脳スライス前のヴィヴォの最初の時間のためにテストします。具体的には、それはアセチルコリンエステラーゼ (AChE) の C 末端から派生した有毒ペプチド投与がトリガー、BF の前後軸に沿った発現の広告のようなプロファイルを求める可能性が実証されています。alpha7 ニコチン性受容体 (α 7-nAChR) など、広告の変更蛋白質は、タウ (p-タウ) とアミロイド β (a β) にリン酸化。
Introduction
広告は (OB)1,2,3、嗅 (EC)、BF、海馬 (HC)、嗅球などの異なった頭脳区域に影響を与える段階的な神経変性障害によって特徴づけられる慢性的な病理 4,5。広告開発の後期の段階は、この病気の約すべての場合6の 70% を占め、認知症の最も一般的なフォームを作り、進行性認知機能の低下に します。初期 AD の原因を理解する広範な試みにもかかわらずない現在、定義された実験的徴候がそれらを解明です。AD の病態も効果的な7,8 を証明している医薬品のターゲットを説明する完全なプロフィールを提供されていないまた、最も人気のある理論 -「アミロイド仮説」- は問わ ,9。
注目されている代替理論神経変性時に発生する初期のメカニズム広告3,10,11に主に影響を受けやすい神経クラスターに関連していることを示唆しています。,12,13,14. OB、HC、EC1615,などの複数の地域が BF、中脳、脳幹、プロジェクト内で包まれてこの異種細胞ハブ。神経細胞の形態、神経伝達物質合成の多様性、にもかかわらず細胞のこのコアは非酵素的関数17,18することも痛みを表現する共通の機能を共有します。シグナリング分子は、Ca2 +線量、可用性、および神経年齢17,18に関連して栄養や有害イベントを受けることができるニューロンにカルシウム (Ca2 +) の流れを仲介する小説としてこの非古典的な役割,19。
神経変性、中に観察された細胞損失かもしれないしたがってこの非酵素的関数17,18,20、関連付けられている痛みの C 末端から切断 30mer ペプチド (T30) に起因するであります。20.、T30 誘導 BF 構造を有するラット脳スライス前のヴィヴォに基づいて新規アプローチを通じて我々 は実証以前の結果は、細胞培養と光イメージング18,21の準備、実施に伴い広告のようなプロファイル22。この新しい手法は時間のタイム ・ ウィンドウのとはいえ、解剖学的から回路保全に至るまで、そのまま組織の特性の多くを維持するための細胞培養よりもより生理的シナリオ提供しています。T30 申請急性反応をモニタリング、神経変性疾患の初期の段階で行われるイベントを探索するこのプロトコルを適用されます。
脳の使い方の文献の大きいボディにもかかわらず神経損傷で暗黙の分子経路を調査するスライスまたはより即時初めて神経新生23,24, このプロトコルを提供し、読み出す敏感な比較脊髄スライスの共通使用。ただし、脳切片の場合、この急性スライス手順できますも採用される特定の工程で発生する主な分子の変化検出神経または神経毒性分子の評価など、いくつかの目的のため免疫組織化学的解析、および中枢神経系の薬理学的アッセイ関連病態です。
Protocol
Representative Results
Discussion
特定のアプリケーションの後の彼らの応答を監視、同じ解剖学的面から取得した 2 つの鏡面 hemislices を同期的にテストすることができます確立前のヴィヴォ脳の技術に基づいて、このプロトコルの主要側面条件 (制御または扱われる);したがって、できるだけしっかりと制御実験パラダイムを提供します。神経変性イベント22日中に見られるように時間、線量 – と部位?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品会社ニューロ バイオで賄われていた我々 感謝したい博士・ ジョヴァンニ ・ Ferrati、博士セルジオ ・ ロトンド (神経生物)、コメントや原稿にアドバイスを。
Materials
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich, Germany | S7653 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich, Germany | P9333 | Reagent for aCSF preparation |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich, Germany | S5761 | Reagent for aCSF preparation |
| Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4 (7H2O)) | Sigma-Aldrich, Germany | 63138 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich, Germany | P5655 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes salt | Sigma-Aldrich, Germany | H7006 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes acid | Sigma-Aldrich, Germany | H3375 | Reagent for aCSF preparation |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Germany | G7528 | Reagent for aCSF preparation |
| Calcium chloride dehydrate | Sigma-Aldrich, Germany | 223506 | Reagent for aCSF preparation |
| T30 peptide | Genosphere Biotechnologies, France | AChE-derived peptide tested | |
| Surgical dissecting kit | World Precision Instruments, USA | Item #: MOUSEKIT | Brain removal step |
| Surgical blades | Swann-Morton, UK | BS 2982 | Brain removal step |
| Filter paper | Fisher Scientific, USA | 11566873 | Brain preparation for slicing |
| Glue | Brain preparation for slicing | ||
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000 S | Slicing |
| Brushes | Tissue handling | ||
| Oxygen canister | Sectioning and incubation phase | ||
| 1x Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific, USA | BP2438-4 | Homogenization step |
| Phosphatase inhibitors | Fisher Scientific, USA | 1284-1650 | Homogenization step |
| Protease inhibitors | Roche complete PIC, USA | 4693116001 | Homogenization step |
| Pestles | Starlab, UK | I1415-5390 | Homogenization step |
| Microcentrifuge | |||
| Pierce 660 nm Protein Assay | Thermo Scientific, USA | 22660 | Protein concentration |
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