En alternativ metod att studera primära händelser i Neurodegeneration använder Ex Vivo råtta hjärnan skivor
Summary
Vi presenterar en metod som kan ge ytterligare insikter i de tidiga händelser som underliggande neurodegeneration och bygger på etablerade ex-vivo brain teknik, kombinerar fördelarna med i vivo och in vitro- experiment. Dessutom innebär det en unik möjlighet för direkt jämförelse av behandlat och obehandlat grupp i samma anatomiska plan.
Abstract
Trots många studier som försöker utveckla tillförlitliga djurmodeller som återspeglar primärt processer underliggande neurodegeneration, har mycket få varit allmänt accepterat. Här föreslår vi ett nytt förfarande som anpassas från välkända ex vivo brain slice tekniken, som erbjuder en närmare i vivo-som scenario än in vitro- preparat, för att utreda de tidiga händelser som utlöser cell degeneration, som hos Alzheimers sjukdom (AD). Denna variation består av enkla och enkelt reproducerbar steg, som möjliggör bevarandet av de anatomiska cytoarchitecture av hjärnregionen valda och dess lokala funktionalitet i en fysiologisk miljö. Olika anatomiska områden kan erhållas från samma hjärnan, vilket ger möjlighet att utföra flera experiment med behandlingarna som är i fråga i en webbplats – dos- och tidsberoende sätt. Potentiella begränsningar som kan påverka resultaten relaterade till denna metod är relaterade till bevarande av vävnad, dvs underhållet av dess anatomiska integritet under skivning och inkubation stegen och snittjocklek, som kan påverka den biokemiska och immunhistokemisk analysen. Detta tillvägagångssätt kan användas för olika ändamål såsom att utforska molekylära mekanismer som är involverade i fysiologiska eller patologiska tillstånd, drogkontroll eller dos-respons-analyser. Slutligen kan detta protokoll också minska antalet djur som anställd i beteendevetenskapliga studier. Programmet redovisas här har nyligen beskrivits och testade för första gången på ex vivo råtta hjärnan skivor som innehåller basala framhjärnan (BF), som är en av de cerebrala regioner som främst drabbade i AD. Specifikt, har det visats att administrationen av en giftig peptid som härrör från C-terminus av acetylkolinesteras (AChE) kunde föranleda en AD-liknande profil, utlösande, längs ryggsköldens axel BF, en differentiell uttryck för proteiner som ändrats i AD, t.ex alpha7 nikotinhaltiga receptorn (α7-nAChR), fosforyleras Tau (p-Tau) och beta-amyloid (Aβ).
Introduction
AD är en kronisk patologi kännetecknas av gradvis neurodegenerativa nedsatt påverkar olika hjärnområden, såsom entorhinal cortex (EG), BF, hippocampus (HC) och luktbulben (OB)1,2,3, 4,5. Sena stadier av AD utveckling leder till en progressiv försämring av kognitiva funktioner, vilket gör denna sjukdom är den vanligaste formen av demens, ungefärligt står för 70% av alla fall6. Trots omfattande försök att förstå de inledande stadierna som orsakar AD, finns det inte för närvarande en definierad experimentella indikation belysa dem. Dessutom, ifrågasätts den mest populära teorin – ”amyloid hypotesen” – alltmer eftersom det inte ger en komplett profil för att förklara den AD patobiologi, och inte heller en farmaceutisk mål som har visat sig effektiv7,8 ,9.
En alternativ teori som får allt större uppmärksamhet tyder på att de inledande mekanismer som inträffar under neurodegeneration är relaterade till ett neuronala kluster primärt mottagliga AD3,10,11 , 12 , 13 , 14. denna heterogena cellulära navet omfattade inom BF, mellanhjärnan och hjärnstammen, projekten till flera regioner, såsom de EG, HC och OB15,16. Trots sin mångfald i neuronala morfologi och signalsubstansen syntes delar denna kärna av celler gemensamt uttrycker värk, som också kan ha en icke-enzymatiska funktion17,18. Denna icke-klassiska roll som en roman signalering molekyl förmedlar kalcium (Ca2 +) flöde in i nervceller som kan genomgå trofiska eller giftiga händelser i förhållande till Ca2 + dos, tillgänglighet och neuronala ålder17,18 , 19.
Under neurodegeneration, kanske observerade cellulära förlusten är därför associerade till denna icke-enzymatiska funktion17,18,20, som är hänförligt till en 30mer peptid (T30) klyvs från värk C-terminus 20. i linje med tidigare resultat, transporteras på cellkultur och optisk imaging18,21 preparat, vi visat, genom en ny metod baserat på ex vivo råtta hjärnan skivor som innehåller BF strukturer, som T30 inducerad en AD-liknande profil22. Specifikt, erbjuder denna nya metod ett mer fysiologiska scenario än cellkultur eftersom det upprätthåller många av egenskaperna av en intakt vävnad, allt från anatomiska till kretsar konservering, om än för ett tidsfönster på timmar. Vi tillämpat detta protokoll för att utforska de händelser som äger rum under tidiga faser av neurodegeneration, övervakning akut svar på T30 ansökan.
Trots den stora mängden litteratur på använder hjärnan skivor att undersöka molekylära vägar antyds i neuronala skador eller neurogenes23,24, detta protokoll för första gången ger en mer omedelbar och känsliga läsa ut jämfört gemensam användning av organotypic skivor. Dock är fallet för organotypic hjärnan sektioner, kan proceduren akut segment också antas för flera ändamål, såsom utvärdering av nervskyddande eller neurotoxiska molekyler, upptäckten av primära molekylära förändringar som sker i en specifik process, immunhistokemisk analys och farmakologiska analyser för centrala nervsystemet relaterade sjukdomar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den viktigaste aspekten av detta protokoll, bygger på väletablerade ex vivo brain teknik, tillåter att synkront testa två speglande hemislices, erhålls från samma anatomiska plan, övervakningen av deras svar efter ansökan av ett specifikt skick (kontroll eller behandlas); Detta erbjuder därför ett experimentella paradigm kontrolleras lika noggrant som möjligt. Möjligheten att utvärdera i en tid – dos- och platsspecifika sätt olika neurochemicals relaterade till neuronala njurfunktion, som sett unde…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av Neuro-Bio Ltd. Vi vill tacka Dr. Giovanni Ferrati och Dr. Sergio Rotondo (Neuro-Bio) för deras kommentarer och råd om manuskriptet.
Materials
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich, Germany | S7653 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich, Germany | P9333 | Reagent for aCSF preparation |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich, Germany | S5761 | Reagent for aCSF preparation |
| Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4 (7H2O)) | Sigma-Aldrich, Germany | 63138 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich, Germany | P5655 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes salt | Sigma-Aldrich, Germany | H7006 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes acid | Sigma-Aldrich, Germany | H3375 | Reagent for aCSF preparation |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Germany | G7528 | Reagent for aCSF preparation |
| Calcium chloride dehydrate | Sigma-Aldrich, Germany | 223506 | Reagent for aCSF preparation |
| T30 peptide | Genosphere Biotechnologies, France | AChE-derived peptide tested | |
| Surgical dissecting kit | World Precision Instruments, USA | Item #: MOUSEKIT | Brain removal step |
| Surgical blades | Swann-Morton, UK | BS 2982 | Brain removal step |
| Filter paper | Fisher Scientific, USA | 11566873 | Brain preparation for slicing |
| Glue | Brain preparation for slicing | ||
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000 S | Slicing |
| Brushes | Tissue handling | ||
| Oxygen canister | Sectioning and incubation phase | ||
| 1x Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific, USA | BP2438-4 | Homogenization step |
| Phosphatase inhibitors | Fisher Scientific, USA | 1284-1650 | Homogenization step |
| Protease inhibitors | Roche complete PIC, USA | 4693116001 | Homogenization step |
| Pestles | Starlab, UK | I1415-5390 | Homogenization step |
| Microcentrifuge | |||
| Pierce 660 nm Protein Assay | Thermo Scientific, USA | 22660 | Protein concentration |
References
- Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathologica. 82 (4), 239-259 (1991).
- Schliebs, R. Basal forebrain cholinergic dysfunction in Alzheimer’s disease–interrelationship with beta-amyloid, inflammation and neurotrophin signaling. Neurochemical Research. 30 (6-7), 895-908 (2005).
- Schmitz, T. W., et al. Basal forebrain degeneration precedes and predicts the cortical spread of Alzheimer’s pathology. Nature Communications. 7, 13249 (2016).
- Fjell, A. M., McEvoy, L., Holland, D., Dale, A. M., Walhovd, K. B. What is normal in normal aging? Effects of aging, amyloid and Alzheimer’s disease on the cerebral cortex and the hippocampus. Progress in neurobiology. 117, 20-40 (2014).
- Kovács, T., Cairns, N. J., Lantos, P. L. Olfactory centres in Alzheimer’s disease: olfactory bulb is involved in early Braak’s stages. Neuroreport. 12 (2), 285-288 (2001).
- Winblad, B., et al. Defeating Alzheimer’s disease and other dementias: a priority for European science and society. The Lancet Neurology. 15 (5), 455-532 (2016).
- Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
- De Strooper, B., Karran, E. The Cellular Phase of Alzheimer’s Disease. Cell. 164 (4), 603-615 (2016).
- Scheltens, P., et al. Alzheimer’s disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
- Arendt, T., Brückner, M. K., Lange, M., Bigl, V. Changes in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in Alzheimer’s disease resemble embryonic development-A study of molecular forms. Neurochemistry International. 21 (3), 381-396 (1992).
- Auld, D. S., Kornecook, T. J., Bastianetto, S., Quirion, R. Alzheimer’s disease and the basal forebrain cholinergic system: relations to β-amyloid peptides, cognition, and treatment strategies. Progress in Neurobiology. 68 (3), 209-245 (2002).
- Arendt, T., Bruckner, M. K., Morawski, M., Jager, C., Gertz, H. J. Early neurone loss in Alzheimer’s disease: cortical or subcortical?. Acta Neuropathol Commun. 3, 10 (2015).
- Mesulam, M. The Cholinergic Lesion of Alzheimer’s Disease: Pivotal Factor or The Cholinergic Lesion of Alzheimer’s Disease: Pivotal Factor or Side Show?. Learn Mem. , 43-49 (2004).
- Schliebs, R., Arendt, T. The cholinergic system in aging and neuronal degeneration. Behavioural Brain Research. 221 (2), 555-563 (2011).
- Mesulam, M. M., Mufson, E. J., Wainer, B. H., Levey, A. I. Central cholinergic pathways in the rat: An overview based on an alternative nomenclature (Ch1-Ch6). Neuroscience. 10 (4), 1185-1201 (1983).
- Mesulam, M., Mufson, E. J., Levey, A. I., Wainer, B. H. Cholinergic innervation of cortex by the basal forebrain: cytochemistry and cortical connections of the septal area, diagonal band nuclei, nucleus basalis (substantia innominata), and hypothalamus in the rhesus monkey. J Comp Neurol. 214 (2), 170-197 (1983).
- Greenfield, S. Discovering and targeting the basic mechanism of neurodegeneration: The role of peptides from the C-terminus of acetylcholinesterase: Non-hydrolytic effects of ache: The actions of peptides derived from the C-terminal and their relevance to neurodegenerat. Chemico-Biological Interactions. 203 (3), 543-546 (2013).
- Garcia-Ratés, S., et al. (I) Pharmacological profiling of a novel modulator of the α7 nicotinic receptor: Blockade of a toxic acetylcholinesterase-derived peptide increased in Alzheimer brains. Neuropharmacology. 105, 487-499 (2016).
- Eimerl, S., Schramm, M. The quantity of calcium that appears to induce neuronal death. Journal of neurochemistry. 62 (3), 1223-1226 (1994).
- Greenfield, S., Vaux, D. J. Commentary Parkinson’s Disease, Alzheimer’s Disease and Motor Neurone Disease: Identifying a Common Mechanism. Science. 113 (3), 485-492 (2002).
- Badin, A. S., Morrill, P., Devonshire, I. M., Greenfield, S. A. (II) Physiological profiling of an endogenous peptide in the basal forebrain: Age-related bioactivity and blockade with a novel modulator. Neuropharmacology. 105, 47-60 (2016).
- Brai, E., Stuart, S., Badin, A. -. S., Greenfield, S. A. A Novel Ex Vivo Model to Investigate the Underlying Mechanisms in Alzheimer’s Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 291 (2017).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
- Jensen, M. S., Lambert, J. D. C., Johansen, F. F. Electrophysiological recordings from rat hippocampus slices following in vivo brain ischemia. Brain Research. 554 (1-2), 166-175 (1991).
- Ferrati, G., Martini, F. J., Maravall, M. Presynaptic Adenosine Receptor-Mediated Regulation of Diverse Thalamocortical Short-Term Plasticity in the Mouse Whisker Pathway. Frontiers in Neural Circuits. 10, 1-9 (2016).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).
- Badin, A. S., John, E., Susan, G. High-resolution spatio-temporal bioactivity of a novel peptide revealed by optical imaging in rat orbitofrontal cortex in vitro: Possible implications for neurodegenerative diseases. Neuropharmacology. 73, 10-18 (2013).
- Greenfield, S. A., Badin, A. S., Ferrati, G., Devonshire, I. M. Optical imaging of the rat brain suggests a previously missing link between top-down and bottom-up nervous system function. Neurophotonics. 4, 31213 (2017).
- Opitz-Araya, X., Barria, A. Organotypic hippocampal slice cultures. Journal of visualized experiments: JoVE. (48), (2011).
- Gong, C. -. X., Lidsky, T., Wegiel, J., Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K. Metabolically active rat brain slices as a model to study the regulation of protein phosphorylation in mammalian brain. Brain Research Protocols. 6 (3), 134-140 (2001).
