Desthiobiotin-streptavidina-affinità mediata purificazione delle proteine che interagiscono con RNA nelle cellule di mesotelioma

Summary

Desthiobiotin etichettatura di un sintetico oligo RNA 25 nucleotidi, che contiene un motivo di elemento ricco di adenina (ARE), permette di grippaggio specifico di proteina citosolica sono vincolanti.

Abstract

Lo in vitro RNA-pulldown è ancora largamente utilizzato nei primi passi di protocolli volti ad identificare RNA-binding proteins che riconoscere specifici RNA strutture e motivi. In questo protocollo RNA-pulldown, commercialmente sintetizzato le sonde del RNA sono etichettate con una forma modificata di biotina, desthiobiotin, all’estremità 3′ del filamento di RNA, che si lega reversibilmente al streptavidina e permette così di eluizione delle proteine sotto più fisiologico condizioni. il RNA-desthiobiotin è immobilizzato tramite interazione con streptavidina su biglie magnetiche, che vengono utilizzati per abbattere le proteine che interagiscono specificamente con il RNA di interesse. Proteine non denaturate e attive da frazione citosolica delle cellule di mesotelioma sono utilizzate come fonte di proteine. Il metodo qui descritto può essere applicato per rilevare l’interazione tra proteine RNA associazione di note e una sonda 25 nucleotidi (nt) lunga RNA contenente una sequenza di interesse. Questo è utile per completare la caratterizzazione funzionale di stabilizzare o destabilizzare gli elementi presenti nelle molecole di RNA ottenute utilizzando un’analisi di vettore reporter.

Introduction

Espressione genica e il livello finale del prodotto del gene può essere strettamente regolate che interessano la stabilità del mRNA e mRNA traduzione tasso¹. Questi meccanismi di regolazione post-trascrizionali sono esercitati attraverso le interazioni di non codificanti proteine RNA e/o RNA-binding (RBPs) con mRNA mirati. È solitamente la regione non tradotta 3′ del mRNA (3′ UTR – appartenendo alla parte non codificante del genoma²) che contiene specifiche cis-elementi regolatori (CRE), che sono riconosciuti da trans-in qualità di fattori quali miRNA o RBPs ³. la migliore studiati cis-elemento all’interno di 3′ UTR, è il motivo di elemento ricco di adenina (ARE), che è riconosciuto da specifiche proteine che legano il AU (AUBP) e, a sua volta, induce la degradazione sia mRNA/deadenylation (decadimento sono-mediata) o mRNA stabilizzazione⁴.

La dimensione del 3′ UTR di calretinina mRNA (CALB2) è 573 bp lungo e contiene un pentamero AUUUA putativo, come predetto da AREsite2, un tool di bioinformatic⁵. Coerente con la presenza di un motivo sono presunto, l’analisi di vettore-reporter di pmirGLO ha dimostrato un ruolo di stabilizzazione di questo elemento all’interno di mRNA di CALB2⁶. Infine, l’ in vitro RNA-pulldown è stato utilizzato per identificare il AUBP che stabilizza calretinina mRNA attraverso il motivo sono.

Poiché tutti gli RNA non codificanti interagisce con proteine⁷, lo in vitro RNA-pulldown è un buon modo e analisi prima della scelta per l’identificazione di interattori di RNA per aiutare a decifrare i meccanismi molecolari. In questo metodo di RNA-pulldown, commercialmente sintetizzato le sonde del RNA, che sono state etichettate con una forma modificata di biotina (desthiobiotin) all’estremità 3′ del filamento di RNA, sono state utilizzate. il RNA-desthiobiotin è immobilizzato tramite interazione con streptavidina su biglie magnetiche, che vengono utilizzati per abbattere le proteine che interagiscono specificamente con l’associazione-RNA di interesse. Proteine non denaturate e attive da frazione citosolica delle cellule di mesotelioma sono utilizzate come fonte di proteine. Tali RNA-proteine vengono eluite dai branelli magnetici, eseguire attraverso un gel di SDS-PAGE 12%, trasferito ad una membrana e sondato con anticorpi differenti.

Nella procedura di purificazione di affinità standard streptavidina-biotina, denaturazione dura condizioni sono necessarie per interrompere il legame biotina-streptavidina irreversibile forte per eluire le proteine rilegate⁸, che potrebbe portare alla dissociazione di complessi proteici. A differenza di biotina, desthiobiotin reversibilmente si lega alla streptavidina e competitivo è spostata con una soluzione tamponata di biotina, consentendo per la delicata eluizione delle proteine ed evitando l’isolamento di naturalmente biotinilati molecole⁹, suggerendo che la tecnica è ideale per isolare i complessi della proteina nativa in condizioni native.

In vitro condizioni vincolanti e rigore, che sono determinate dalla concentrazione salina, agenti riducenti e percentuale di detergente, dovrebbe essere vicine a quelle presenti nel contesto del cellulare al fine di identificare le interazioni vere in vivo . Le condizioni di associazione implementate nel presente documento sono state dimostrate in precedenza come appropriato per l’identificazione del HuR come un AU-binding protein¹⁰. Questo approccio potrebbe risparmiare tempo, poiché l’ottimizzazione delle condizioni di associazione corretto può essere lungo e impegnativo. Inoltre, questo metodo potrebbe essere usato come un protocollo di partenza per qualsiasi esperimento di RNA-pulldown e può essere ottimizzato gradualmente cambiando la concentrazione di sali e detergenti, modificando la percentuale di glicerolo, e aggiungendo altri sali. Inoltre, abbiamo dimostrato che anche una breve 25 nucleotidi RNA-sonda che harboring un pentamero sono-motivo poteva essere utilizzato per dimostrare l’interazione con un AUBP specifico.

Protocol

1. preparazione di frazione delle proteine citosoliche e nucleari Piatto 4 x 106 ACC-MESO-4 cellule in un matraccio di cultura cellulare T150 coltivate in RPMI – 1640 medio completati con 10% FBS, 1 x penicillina/streptomicina (100x) e 2 mM L-Glutammina (200 mM). Quando le cellule raggiungono una confluenza di 80-90% (~5-5.5 x 106 cellule), procedere con estrazione della proteina della frazione citosolica e nucleare.Nota: ACC-MESO-4 linea cellulare è stata ottenuta dal RIKEN BioResour…

Representative Results

In questo esperimento, un frammento lungo 25-nt di calretinin 3′ UTR harboring sono motivo (CALB2 3′ UTR (ARE) 25-nt) è stato utilizzato per verificare se si lega specificamente alla proteina umana-antigene R (HuR), un noto stabilizzatore di mRNA. Per verificare la specificità dell’elemento sono, un RNA 25-nt sonda CALB2 3′ UTR (mtARE) contenente una mutazione sono-motivo, che precedentemente è stata indicata ad abolire l’effetto di stabilizzazione del motivo sono, era usato<sup class=…

Discussion

3′ UTR appartengono al genoma non codificante³e tutti gli RNA non codificanti possa interagire con proteine al fine di esercitare la loro funzione⁷. Quando il genoma dei mammiferi è stato trovato per essere trascritto pervasively e prodotto una porzione significativa di lunghi non codificanti RNA¹⁶, emergenti evidenze hanno dimostrato che questi RNA non codificante lungo funzionano nella regolazione dell’espressione genica come essi interagiscono co…

Materials

NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction kit	Thermo Fisher Scientific	78833
Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free	Thermo Fisher Scientific	A32965
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23225
Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit	Thermo Fisher Scientific	20164	Includes magnetic beads and therefore the kit need to be stored at 4 °C
Pierce RNA 3’ End Desthiobiotinylation Kit	Thermo Fisher Scientific	20163	The kit is a part of the "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit", and needs to be stored at -20 °C unlike the pull-down kit (4 °C).
DynaMag-2,  magnetic stand	Thermo Fisher Scientific	12321D
Anti – HuR (MOUSE) monoclonal antibody	Thermo Fisher Scientific	–	The antibody is included in the Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit  – 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS
Anti – α – tubulin (MOUSE) monoclonal antibody	Santa Cruz	8035	1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS
Anti – PARP (RABBIT) Polyclonal antibody	Cell Signaling	9542	1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS
Anti – Mesothelin (MOUSE) Monoclonal Antibody	Rockland	200-301-A87
Secondary goat anti-rabbit antibody	Cell Signaling	7074
Secondary rabbit anti-mouse antibody	Sigma-Aldrich	A-9044
RPMI – 1640 medium	Sigma-Aldrich	R8758
FBS – Filtrated Bovine Serum	Pan Biotech	P40-37500
Penicillin – streptomycin (100x)	Sigma-Aldrich	P4333
L-Glutamine solution (200 mM)	Sigma-Aldrich	G7513
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco by Life technologies	25200-056
Mini-PROTEAN 3 Cell	Bio-Rad	1653301
Mini Protean System Glass Plates	Bio-Rad	1653308
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 1.5 mm integrated spacer	Bio-Rad	1653312
Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1.5 mm, 66 µL	Bio-Rad	1653365
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules	Bio-Rad	1658050
RNaseZap RNase Decontamination Solution	Thermo Fisher Scientific	AM9780
Rotiphorese gel 30 – aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ration of 37.5:1	Roth	3029
20% SDS	PanReac AppliChem	A3942
PVDF transfer membrane	Perkin Elmer	NEF1002	Need to be activated by incubating in pure methanol for 1 min followed by washing in water for 2 min
Trans-Blot SD semi-dry transfer cell	Bio-Rad	1703940
Clarity Western ECL Substrate	Bio-Rad	1705061
FusionFX  Digital Imager	Vilber	–
RNA oligo synthesis	Mycrosynth AG, Switzerland	–	the synthesis scale – 0.04 µmol – HPLC purified
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7030
Hydrochloric Acid (HCl) 6 M	PanReac AppliChem	182883.1211
Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5	Thermo Fisher Scientific	15567027
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	17904	50% sterile aliquots to be stored at -20°C
Pierce Streptavidin magnetic beads	Thermo Fisher Scientific	88817	Please note that these magnetic beads have an average diameter of 1 µm (range from 0.5 – 1.5 µm). Furthermore, Dynabeads-M280 Streptavidin, which are beads of homogenouse size 2.8 µm, are also used in RNA-pulldown but be aware that this may affect purification process.
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Coomassie G-250	Applichem	A3480
Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate	Sigma-Aldrich	368458
ortho-phosphoric acid	Applichem	A0637