Summary
وسم ديسثيوبيوتين من الاصطناعية في اليغو رنا 25-النوكليوتيدات، الذي يحتوي فكرة الغنية الأدنين عنصر (ARE)، يسمح ملزمة محددة من سيتوسوليك هي ملزمة البروتين.
Abstract
في المختبر المنسدلة الحمض النووي الريبي لا تزال إلى حد كبير يستخدم في الخطوات الأولى للبروتوكولات الرامية إلى تحديد البروتينات الحمض النووي الريبي الملزمة التي تعترف بهياكل الحمض النووي الريبي وزخارف محددة. في هذا البروتوكول المنسدلة الجيش الملكي النيبالي، تتم تسمية المركب تجارياً الحمض النووي الريبي تحقيقات مع صيغة معدلة من البيوتين، ديسثيوبيوتين، في المحطة 3 ' من حبلا الجيش الملكي النيبالي، الذي عكسية بربط streptavidin، ويسمح بالتالي شطف بروتينات تحت أكثر فسيولوجية شروط. الجيش الملكي النيبالي--ديسثيوبيوتين هو المعطل تداولها من خلال التفاعل مع ستريبتافيدين على حبات المغناطيسية، التي تستخدم لهدم البروتينات على وجه التحديد تتفاعل مع الحمض النووي الريبي للفائدة. وتستخدم كمصدر للبروتينات البروتينات عدم-التشويه والتحريف والنشطة من الكسر سيتوسوليك من خلايا ورم الظهارة المتوسطة. يمكن تطبيق الطريقة الموضحة هنا للكشف عن التفاعل بين الجيش الملكي النيبالي المعروف ملزم البروتينات ومجس الحمض النووي الريبي طويل 25-النوكليوتيدات (nt) التي تحتوي على تسلسل فائدة. وهذا مفيد لاستكمال توصيف وظيفي استقرار أو زعزعة استقرار العناصر الموجودة في جزيئات الحمض النووي الريبي تحقيقه باستخدام مقايسة متجه مراسل.
Introduction
التعبير الجيني والمستوى النهائي للمنتج الجيني يمكن أحكام ينظمها التي تؤثر على استقرار مرناً ومرناً الترجمة معدل1. هذه الآليات التنظيمية بوستترانسكريبشونال تمارس عن طريق التفاعلات غير الترميز الحمض النووي الريبي و/أو الحمض النووي الريبي ملزم البروتينات (الممارسات التجارية التقييدية) مع مرناً المستهدفة. أنها عادة ما تكون المنطقة 3 'غير مترجمة من مرناً (3' UTR-الذين ينتمون إلى الجزء غير ترميز الجينوم2) الذي يحتوي على محدد رابطة الدول المستقلة-العناصر التنظيمية (CRE)، التي تعترف بها ترانس-تعمل بعوامل مثل ميرنا أو الممارسات التجارية التقييدية 3-درس أفضل رابطة الدول المستقلة-هو عنصر داخل 3 ' UTR، عزر الأدنين-الغنية بعنصر (ARE)، الذي يعترف بالبروتينات الاتحاد الأفريقي ملزمة محددة (أوبب)، وفي المقابل، يدفع أما مرناً تدهور/ديدينيليشن (هي بوساطة تسوس) أو مرناً الاستقرار4.
الحجم 3 ' UTR من كالريتينين مرناً (CALB2) هو 573 bp طويلة ويحتوي بينتامير أويووا المفترضة، كما تنبأ بها AREsite2، أداة بيوينفورماتيك5. تمشيا مع وجود فكرة هي المفترضة، تحليل المتجهات-مراسل بميرجلو أظهر بدور تحقيق استقرار لهذا العنصر داخل مرناً CALB26. وأخيراً، في المختبر المنسدلة الحمض النووي الريبي استخدمت لتحديد أوبب أن تستقر كالريتينين مرناً من خلال فكرة هي.
منذ الكشف غير ترميز جميع تتفاعل مع البروتينات7، في المختبر المنسدلة الحمض النووي الريبي هو طريقة جيدة والفحص الأولى للاختيار لتحديد الحمض النووي الريبي-التمثيلات للمساعدة في فك رموز الآليات الجزيئية. واستخدمت في هذا الأسلوب، والجيش الملكي النيبالي-المنسدلة المركب تجارياً تحقيقات الجيش الملكي النيبالي، الذي تم تسميته بصيغة معدلة من البيوتين (ديسثيوبيوتين) في المحطة 3 ' من حبلا الحمض النووي الريبي،. الجيش الملكي النيبالي--ديسثيوبيوتين هو المعطل تداولها من خلال التفاعل مع ستريبتافيدين على حبات المغناطيسية، التي تستخدم لهدم البروتينات التي تتفاعل على وجه التحديد مع ربط-الجيش الملكي النيبالي للفائدة. وتستخدم كمصدر للبروتينات البروتينات عدم-التشويه والتحريف والنشطة من الكسر سيتوسوليك من خلايا ورم الظهارة المتوسطة. يتم التيد مثل البروتينات المرتبطة الحمض النووي الريبي من الخرز المغناطيسي، تشغيل من خلال جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة 12% ونقلت لغشاء وسبر مع الأجسام المضادة المختلفة.
في معيار streptavidin-البيوتين تقارب تنقية الإجراء، تمسخ قاسية هي الشروط اللازمة لعرقلة بوند البيوتين لا رجعة قوية-ستريبتافيدين الوت البروتينات منضم8، مما قد يؤدي إلى الانفصال من مجمعات البروتين. خلافا البيوتين، ديسثيوبيوتين عكسية بربط streptavidin وشرد تنافسية مع حل مخزنة من البيوتين، مما يسمح شطف لطيف من البروتينات، وتجنب عزل بطبيعة الحال بيوتينيلاتيد الجزيئات9، مما يدل على أن هذه التقنية مثالية لعزل مجمعات البروتين الأصلي تحت ظروف السكان الأصليين.
ينبغي أن تكون قريبة من تلك الموجودة في سياق الخلوية في المختبر الشروط الملزمة والتقشف، التي يتم تحديدها بواسطة تركيز الملح وعوامل تخفيض النسبة المئوية المنظفات، بغية تحديد التفاعلات الحقيقية في فيفو . لقد ثبت شروط ملزمة تنفيذ هذه الوثيقة سابقا حسب الاقتضاء لتحديد هور الاتحاد الأفريقي ملزمة بروتين10. هذا النهج يمكن أن تنقذ الوقت، نظراً للاستفادة المثلى شروط الربط السليم يمكن أن تكون صعبة وتستغرق وقتاً طويلاً. وبالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب يمكن أن تستخدم كبروتوكول انطلاق لأي تجربة المنسدلة الجيش الملكي النيبالي ويمكن أن يكون الأمثل تدريجيا بتغيير تركيز الأملاح والمنظفات وتغيير النسبة المئوية والغليسيرول وإضافة الأملاح الأخرى. وعلاوة على ذلك، أثبتنا أن حتى قصير 25-النوكليوتيدات الجيش الملكي النيبالي-تحقيق إيواء بينتامير هي فكرة يمكن أن تستخدم لإظهار التفاعل مع أوبب محددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد جزء من البروتين سيتوسوليك والنووية
- لوحة 4 × 106 لجنة التنسيق الإدارية--ميزو-4 خلايا في قارورة ثقافة خلية T150 نمت في ربمي-المتوسطة 1640 تستكمل مع 10% FBS، 1 x البنسلين/ستربتوميسين (100 x)، ومم 2 لتر-الجلوتامين (200 ملم). عندما تصل الخلايا إلى الجمع بين 80-90% (~5-5.5 x 106 خلايا)، المضي قدما في استخراج البروتين من الكسر النووية وسيتوسوليك.
ملاحظة: تم الحصول على خط الخلية لجنة التنسيق الإدارية--ميزو-4 من مركز بيوريسورسي "بتبريد"11. - نضح المتوسطة وغسل الخلايا بإضافة 15 مل من س 1 برنامج تلفزيوني وآماله اللوحة بلطف عدة مرات ونضح برنامج تلفزيوني 1 x. أضف 3 مل من 0.25% يدتا التربسين واحتضان قارورة الثقافة في 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
ملاحظة: انظروا إلى الخلايا تحت المجهر لمفرزة؛ إذا كان لا يزال يعلق الصنبور قارورة ضد كف يد 3 مرات. - إضافة 7 مل متوسط RPMI 1640 تستكمل مع 10% FBS والبنسلين 1 x/ستربتوميسين (100 x) مم 2 لتر-الجلوتامين (200 ملم) وجمع الخلايا في أنبوب 15 مل، وتدور إلى أسفل في 200 غ س لمدة 5 دقائق.
- نضح المتوسطة ريسوسبيند بيليه الخلية مع 1.5 مل من 1 x PBS، ثم نقل الخلايا في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. تدور إلى أسفل في ز 500 x و 4 درجات مئوية عن أدنى 5 تجاهل المادة طافية.
ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا، القيام بجميع الخطوات الطرد المركزي في 4 درجات مئوية وتبقى جميع الكواشف على الجليد. - ريسوسبيند بيليه الخلية مع المثلج مل 1.5 من برنامج تلفزيوني x 1 وزيادة ونقصان لأسفل الخلايا في 500 x ز و 4 درجات مئوية للحد الأدنى 3 تجاهل المادة طافية.
ملاحظة: المبالغ المطلوبة من وحدات خفض الانبعاثات المعتمدة الأول والثاني CER والكاشفات NER هي 10 و 0.55 و 5 مجلدات من الخلية المقدرة بيليه وجبات وحدة التخزين، على التوالي؛ البروتوكول التالي يفترض حجم 20 ميليلتر. نحن نوصي بإعداد فقط المبلغ المطلوب لكاشف CER أنا. - إضافة 200 ميليلتر لاستخراج هيولى المثلج كاشف (CER أنا) تستكمل مع 2 ميليلتر من 1 × مثبط بروتيناز، مثلاً، يؤدي إلى تمييع 1 حبة من "مثبطات البروتياز" (يدتا الحرة) في 500 ميليلتر من الماء للحصول على الأوراق المالية x 100. هذا المبلغ من كاشف التخفيض ما يكفي 20 ميليلتر بيليه الخلية وجبات وحدة التخزين.
- ولتقدير حجم الخلية بيليه وجبات، قارن الأنبوب الذي يحتوي على خلية بيليه مع أنبوب 1.5 مل مليئة 10 أو 20 أو 50 أو 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x.
- ريسوسبيند بيليه الخلية بشدة فورتيكسينج الأنبوبة لمدة 15 ثانية واحتضان الأنبوب على الجليد للحد الأدنى 10 11 إضافة ميليلتر لاستخراج هيولى المثلج كاشف (CER الثاني) إلى الأنبوبة، دوامة بقوة 5 s، واحتضان 1 دقيقة على الجليد.
- دوامة لقوة 5 s والطرد المركزي الأنبوب في 16,000 س ز و 4 درجات مئوية للحد الأدنى 5 نقل المادة طافية إلى أنبوب مبردة مسبقاً نظيفة على الجليد. المادة طافية هو الكسر هيولى أن كذلك استخدمت في التجربة المنسدلة الجيش الملكي النيبالي.
- ريسوسبيند بيليه المتبقية في 100 ميليلتر من استخراج النووية المثلج كاشف (NER) تستكمل مع 1 ميليلتر مثبط البروتيناز (100 س) وشدة دوامة لمدة 15 ثانية. نحن نوصي بإعداد فقط المبلغ المطلوب لكاشف NER تستكمل مع مثبطات البروتياز.
- احتضان العينة على الجليد لمدة 40 دقيقة مع فورتيكسينج أحياناً لمدة 15 ثانية (كل 10 دقائق).
- الطرد المركزي الأنبوب في س 16,000 ز عن 10 دقيقة نقل المادة طافية (هذا هو الكسر البروتين النووي) لأنبوب مبردة مسبقاً نظيفة.
- الشروع فورا بقياس تركيز البروتين باستخدام الأسلوب بيسينتشونينيك (اتفاق التعاون الأساسي) (انظر الجدول للمواد). للتحكم في للبروتين نقاء كل جزء، أداء immunoblotting (الشكل 1) ضد α-tubulin (الكشف إيجابية فقط في جزء سيتوسوليك) وبولي ADP-الريبوز بوليميريز-نشطت (الكشف إيجابية إلا في جزء صغير النووية). للتصور البروتين، والرجوع إلى المادة 4.
- من أجل الحفاظ على نشاط البروتين ودولته الأصلية، تعد 25 ميليلتر من مختبرين لمقتطفات سيتوسوليك والنووية. الأداة الإضافية-تجميد هذه مختبرين بوضعها في النتروجين السائل 5 s ومخزن مباشرة في-80 درجة مئوية.
2-وضع العلامات للجيش الملكي النيبالي مع ديسثيوبيوتين
- تحقيقات الجيش الملكي النيبالي تصنيعه تجارياً وتنقيته [هبلك]. ريسوسبيند بمياه خالية من نوكلاس في 10 ميكرون.
ملاحظة: يتم سرد تسلسل التحقيق في الجدول 1. - استخدام pmol 50 من الحمض النووي الريبي لرد فعل الجيش الملكي النيبالي-المنسدلة. ذوبان الجليد، وإبقاء جميع الكواشف على الجليد إلا لربط 30 ٪، تستخدم لتسمية 3 ' تيرمينوس للجيش الملكي النيبالي اليغو.
- نقل 5 ميليلتر من 10 تحقيقات الجيش الملكي النيبالي ميكرومتر، وصفت بأنها CALB2 3 'UTR (ARE)، CALB2 3' UTR (متري)، وأونريلاتيد--الحمض النووي الريبي (غضب)، إلى 0.5 مل رقيقة الجدار ميكروسينتريفوجي أنابيب واحتضان في جهاز PCR في 85 درجة مئوية للحد الأدنى 5 وضع الأنابيب فورا على الجليد.
ملاحظة: هذه الخطوة هامة، إذ أنها تعزز بالاسترخاء وإمكانية الوصول لمسبار الحمض النووي الريبي لوضع العلامات. - لفعل 30 ميليلتر واحد، إضافة إلى الأنبوبة المحتوية على الحمض النووي الريبي المزيج 10 ميليلتر التالية: 3 ميليلتر من المياه مجاناً نوكلياسي، 3 ميليلتر من 10 × الجيش الملكي النيبالي ليجاسى رد فعل المخزن المؤقت، 1 ميليلتر من "مثبط رناسي" (يو 40/ميليلتر)، 1 ميليلتر من "ديسثيوبيوتينيلاتيد سيتيديني بيسفوسفاتي" (1 ملم) ، و 2 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي T4 ليجاسى (20 ش/ميليلتر).
ملاحظة: إعداد A مزيج الرئيسي للعينات 3 في الزائدة (3.2)، مزيج 9.6 ميليلتر من نوكلاس المياه مجاناً، ميليلتر 9.6 من 10 × الجيش الملكي النيبالي ليجاسى رد فعل المخزن المؤقت، ميليلتر 3.2 من "مثبط رناسي" (يو 40/ميليلتر)، 3.2 ميليلتر من "ديسثيوبيوتينيلاتيد سيتيديني بيسفوسفاتي" (1 ملم)، وميليلتر 6.4 من الحمض النووي الريبي T4 ليجاسى (20 ش/ميليلتر). - إضافة ربط بعناية 15 ميليلتر من 30% إلى رد الفعل. استخدام تلميح آخر إلى خلط رد فعل. تبني رد فعل بين عشية وضحاها في 16 درجة مئوية.
- في اليوم التالي، إعداد ما يلي: 5 "م كلوريد الصوديوم" (طازجة/نوكلاس الحرة)، كلوروفورم: إيسواميل الكحول بنسبة 24:1 (مثلاً، كل رد فعل-96 ميليلتر كلوروفورم و 4 ميليلتر من الكحول إيسواميل)، المثلج 100 ٪ الإيثانول، والمثلج 70% إيثانول.
- إضافة ميليلتر 70 من المياه خالية من نوكلياسي للأنابيب رد فعل وسم الحمض النووي الريبي. إضافة 100 ميليلتر من كلوروفورم: إيسواميل الكحول ودوامه بإيجاز. تدور إلى أسفل في 13,000 س ز لإزالة الحد الأدنى 3 بعناية فقط بالمرحلة العليا ونقلها إلى أنبوب خالية نوكلاس 1.5 مل جديدة؛ تجنب لمس في المرحلة الدنيا.
- إضافة 10 ميليلتر كلوريد الصوديوم م 5، 1 ميليلتر من الجليكوجين وميليلتر 300 المثلج 100 ٪ الإيثانول. ضع الأنبوبة في-20 درجة مئوية ح 2.
ملاحظة: في هذه الخطوة، يمكن أن تستمر التجربة في اليوم التالي. - أجهزة الطرد المركزي في 13,000 س ز و 4 درجات مئوية عن 15 دقيقة بعناية تجاهل المادة طافية دون إزعاج بيليه. إضافة 300 ميليلتر من المثلج 70% إيثانول والطرد المركزي مرة أخرى في 13,000 س ز و 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- تجاهل المادة طافية تماما وأيردري بيليه (15 دقيقة). ريسوسبيند بيليه في 20 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس.
ملاحظة: المضي قدما في الجيش الملكي النيبالي-الواقعة في نفس اليوم. - احتضان الجيش الملكي النيبالي في 90 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ثم ضع على الجليد. ضع المسمى-الجيش الملكي النيبالي على الجليد خلال الخطوة التالية لما قبل غسيل الخرز المغناطيسية ستريبتافيدين.
ملاحظة: فترة حضانة أطول قد تضر مسبار الحمض النووي الريبي.
3-الجيش الملكي النيبالي بالبروتين المنسدلة
-
ما قبل الغسيل ستريبتافيدين المغناطيسي الخرز والحضانة مع ديسثيوبيوتين-الجيش الملكي النيبالي
- استخدام 50 ميليلتر من streptavidin المغناطيسي الخرز الواحدة 50 pmol الجيش الملكي النيبالي. ومع ذلك، وهذا ينبغي أن يكون الأمثل اعتماداً على التجربة.
- قطع دوامة الأنبوب مع الخرز streptavidin المغناطيسي 15 s، وسرعة إزالة 200 ميليلتر (مزيج الرئيسي؛ ويكفي لردود فعل 3 + 1) في استخدام صندوق الأمانات-قفل الأنبوبة نظيفة 1.5 مل نصائح ماصة. وضع الأنبوب على الوقوف مغناطيسي بحيث جمع إلى جانب الأنبوب الخرز وانتظر 1 دقيقة إزالة السائل استثارة.
- ليغسل الخرز، وإزالة الأنبوب من موقف المغناطيسي، إضافة 400 ميليلتر من 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم، 0.05 "م كلوريد الصوديوم"، والحل بلطف بيبيت صعودا وهبوطاً عدة مرات. ضع الأنبوب مرة أخرى على موقف المغناطيسية. انتظر 1 دقيقة وجمع المادة طافية. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
- أغسل حبات مع 200 ميليلتر من 100 ملم كلوريد الصوديوم. إزالة المادة طافية.
- إضافة 200 ميليلتر من عيار 20 ملم تريس (درجة الحموضة 7.5)، ريسوسبيند حبات من بيبيتينج ووضع الأنبوب على الوقوف المغناطيسية والانتظار لمدة 1 دقيقة وإزالة المادة طافية. كرر الخطوة.
- إزالة الأنبوب من موقف المغناطيسية وإضافة 200 ميليلتر من 1 × المخزن المؤقت للالتقاط الجيش الملكي النيبالي ريسوسبيند ستريبتافيدين المغناطيسي الخرز قبل فترة وجيزة من فورتيكسينج. إزالة 50 ميليلتر من ستريبتافيدين المغناطيسي الخرز، وإضافة إلى الأنبوبة المسماة الجيش الملكي النيبالي كل استخدام تلميح قطع ماصة. الأنابيب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على اسطوانة احتضانها.
-
ملزمة للبروتين للجيش الملكي النيبالي
- وضع الأنابيب في موقف مغناطيسي، انتظر 1 دقيقة، وإزالة المادة طافية.
- إضافة 50 ميليلتر من عيار 20 ملم تريس (درجة الحموضة 7.5) إلى الخرز وريسوسبيند بيبيتينج. وضع الأنابيب في موقف مغناطيسي، انتظر 1 دقيقة، وإزالة المادة طافية. كرر هذه الخطوة.
- إضافة 100 ميليلتر من 1 س رنا البروتين ملزمة المخزن المؤقت إلى الخرز وريسوسبيند بيبيتينج.
- وفي الوقت نفسه، يعد هذا المزيج التالي: 10 ميليلتر من 10 x العازلة ملزمة البروتين-الجيش الملكي النيبالي, 30 ميليلتر من الجلسرين 50%, 50 ميكروغرام هيولى البروتينات، وخالية من نوكلاس المياه تصل إلى 100 ميليلتر.
ملاحظة: إعداد مزيج الرئيسي ب 3 عينات في الزائدة (3.3) كما يلي: 33 ميليلتر من 10 × العازلة ملزمة البروتين-الجيش الملكي النيبالي، ميليلتر 99 من والغليسيرول 50%، ميكروغرام 165 من البروتينات هيولى وخالية من نوكلاس المياه تصل إلى 330 ميليلتر. إبقاء أنبوب مزيج الرئيسي ب على الجليد. - ضع الأنابيب في موقف المغناطيسي، انتظر 1 دقيقة وجمع المادة طافية. إضافة 100 ميليلتر من مزيج الرئيسي ب، ريسوسبيند بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً، وتجنب خلق الفقاعات. أنابيب رد فعل لمدة 60 دقيقة في 4 درجات مئوية على اسطوانة احتضانها.
-
الغسيل وشطف
- وضع الأنابيب في موقف مغناطيسية، وجمع المادة طافية (وهو التدفق من خلال-متر)، ونقل في أنبوب جديد.
ملاحظة: يبقى هذا متر على الجليد لتحليلها في وقت لاحق. - "الماصة؛" 100 ميليلتر من 1 × المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي في الخرز وريسوسبيند برفق ووضع العودة إلى موقف المغناطيسية، وانتظر 1 دقيقة وتجاهل المادة طافية. كرر هذه الخطوة 2 مرات.
- إضافة 40 ميليلتر من "شطف المخزن المؤقت" الخرز المغناطيسي، مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً، واحتضان في 37 درجة مئوية في أنبوب شاكر (950 لفة في الدقيقة) لمدة 30 دقيقة.
- وضع الأنابيب في موقف مغناطيسي، انتظر 1 دقيقة، وجمع العينة التيد (وهو النذرة-E). على الجليد، وتستخدم لتحليل المتلقين للمعلومات.
ملاحظة: في هذه الخطوة، يتكون كل اختبار الحمض النووي الريبي المسبار من التدفق عبر (قدم) وعينه النذرة (ﻫ).
- وضع الأنابيب في موقف مغناطيسية، وجمع المادة طافية (وهو التدفق من خلال-متر)، ونقل في أنبوب جديد.
4-polyacrylamide التفريد وغربية لطخة تحليل
ملاحظة: انظر الجدول 2 لوصفات للمخازن المؤقتة المستخدمة في هذا القسم. أداء الغربية وصمة عار ووفقا للأسلوب لايملي12.
- هاندكاست 12% الحزب الديمقراطي الصربي صفحة الجل (10-الآبار، ومباعدة 1.5 مم، 66 ميليلتر). إعداد مزيج هلام قيد تشغيل: المخزن المؤقت 4 مل حل الأسهم 30% اكريلاميد-بيساكريلاميدي، 2.4 مل من تريس السفلي، 3.2 مل من dH2س، 9.6 ميليلتر من تيميد، ميليلتر 96 الحل فوق كبريتات الأمونيوم 10% (الجزائرية). إعداد التراص هلام ميكس: مل 3.25 درهم2س، 0.5 مل من 30% اكريلاميد-بيساكريلاميدي حل الأسهم، 1.3 مل من المخزن المؤقت تريس العلوي، 10 ميليلتر من تيميد، ميليلتر 20% 10 وكالة الأنباء الجزائرية.
- إضافة ميليلتر 16.6 6 x Laemmli المخزن المؤقت (مثلاً، 14 مل من تريس/HCl/الحزب الديمقراطي الصربي الأس الهيدروجيني 6.8 (المخزن المؤقت تريس العلوي)، ز 2 من الحزب الديمقراطي الصربي، ز 1.86 من DTT، 6 مل من الجلسرين، و 0.012% bromophenol الأزرق؛ المخزنة في-20 درجة مئوية) في العينة متر، وميليلتر 6.6 من 6 x Laemmli المخزن المؤقت ه عينة. احتضان عينات لمدة 5 دقائق في 95 درجة مئوية.
- تحميل العينات (الوت ميليلتر 20 متر وكل ميليلتر ~ 40) وتشغيلها لمدة 30 دقيقة 60 الخامس، تواصل مع 20 الخامس بين عشية وضحاها.
- باستخدام نظام اليكتروبلوتينج شبه جاف، نقل البروتينات إلى غشاء PVDF لمدة 80 دقيقة في 15 الخامس.
ملاحظة: يجب تنشيط الغشاء PVDF قبل تنفيذ عملية نقل البروتين. احتضان الغشاء في الميثانول 100% 1 دقيقة، متبوعاً حضانة 2 دقيقة في الماء عالي النقاوة. - بعد نقل البروتين، احتضان جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة مع أخذ الحل ح 3، تليها ثلاث خطوات للغسيل بالماء عالي النقاوة، وكل 30 دقيقة.
- في نهاية نقل البروتين، اسمحوا الغشاء PVDF الجاف لتنشيط حاء 1 الغشاء كما هو مبين في الخطوة 4، 5. كتلة الغشاء ح 1 مع جيش صرب البوسنة 5% في 1 x TTBS.
- احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولى: هور أو ميسوثيلين، على حد سواء المخفف 1: 1000 في جيش صرب البوسنة 5% في x TTBS 1 ح 4 في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- يغسل الغشاء ثلاث مرات لمدة 7 دقائق في 1 x TTBS، واحتضان مع أرنب الماوس المضادة الفجل البيروكسيديز (HRP)-تضعف جسم الثانوي مترافق المضيفين في 5% جيش صرب البوسنة، 1 x TTBS.
- تصور البروتينات استخدام تشيميلومينيسسينسي المحسن وجهاز تصوير رقمي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذه التجربة، استخدمت 25-nt جزء طويل من كالريتينين 3 'UTR إيواء هي الحافز (CALB2 3' UTR (ARE) 25-nt) لاختبار ما إذا كان هو ملزم على وجه التحديد للبروتين R الإنسان-مستضد (هور)، عامل استقرار مرناً معروفة. لاختبار خصوصية العنصر هي، الحمض النووي الريبي 25-nt كان مسبار CALB2 3 ' UTR (متري) التي تحتوي على الطفرات هي الحافز، الذي أبدى سابقا إلغاء تأثير الحافز على تحقيق الاستقرار، تستخدم6. الجيش الملكي النيبالي الثالث التحقيق يمثل عنصر التحكم السلبي، الذي هو 28-nt لا علاقة لها الجيش الملكي النيبالي يحتوي على عنصر الحديد-استجابة محددة تحديداً جيدا (لا علاقة لها الحمض النووي الريبي (غضب))، معروفة لربط البروتين المراعية للحديد سيتوسوليك13،14. ولما هور يغلب المترجمة داخل نواة ولكن مهام كعامل استقرار-مرناً في سيتوسول15، أنجز استخراج النووية/سيتوسوليك الحصول على البروتينات النشطة سيتوسول.
لإثبات نقاء الكسور النووية/سيتوسوليك، وجرى تحليل البروتينات بوصمة عار الغربية، التي أظهرت أن α-tubulin اكتشفت فقط في الكسر سيتوسوليك، بينما تم الكشف عن البروتين نشطت فقط في الكسر النووية، كما كان متوقعا ( الشكل 1). النذرة من CALB2 3 'UTR أظهر التحقيق هي ملزمة هور بينما هور كان غائبا في النذرة من المسخ التحقيق كالب 3' UTR (متري). وكان هور أيضا غائبة في النذرة من مسبار الحمض النووي الريبي لا علاقة لها الذي يربط البروتين المراعية للحديد (الشكل 2A). ولزيادة توضيح الخصوصية بين كالب 3 ' UTR (ARE) والحر، بالإضافة إلى ذلك تم سبر الغشاء مع الأجسام المضادة-ميسوثيلين (مسلن)، هذا البروتين لا تتفاعل مع الحمض النووي الريبي. الواتس من كل ثلاث عينات أظهرت لا وجود ميسوثيلين. أخذت معا، يشير هذا إلى أن فكرة هي تحقيق الاستقرار داخل CALB2 3 ' UTR تحديداً ربط البروتين هور.
أخذ تلطيخ جل (الشكل 2) يظهر أن تستخدم كميات متساوية من البروتينات لاحتضان مع تحقيقات الجيش الملكي النيبالي ثلاثة مختلفة. بسبب انخفاض كمية من استخراج سيتوسوليك المستخدمة ونقل للغشاء، هذا تلطيخ لم تسمح بالكشف عن البروتينات في النذرة (ﻫ) الممرات، التي تم الكشف عنها بخلاف ذلك بتحليل لطخة غربية.
رقم 1: تحليل لطخة غربية من 5 ميكروغرام من جزء من البروتين سيتوسوليك والنووية- نشطت البروتين موجود في الكسر النووية (ن) ولكن غائبة عن الكسر (ج) سيتوسوليك. Α-tubulin موجود في الكسر سيتوسوليك (ج) لكن غائبة في الكسر النووية (N). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: يبين لطخة غربية أن هور يتم التقاطها بواسطة CALB2 25-nt 3 ' UTR (ARE). A) متر: من خلال تدفق بعد الحضانة مع الحمض النووي الريبي التحقيق؛ هاء: البروتينات التيد عند الاحتضان ويَسْبِر ملزمة للجيش الملكي النيبالي. تحقيقات: CALB2 UTR (متاري)-25-nt جزء من كالريتينين UTR يحتوي على 3 النيوكليوتيدات تحور داخل عزر هي؛ 3 '3' جولة أوروغواي الحمض النووي الريبي (غضب)-28-nt الحمض النووي الريبي التحقيق مع عنصر المعالم مراعية لحديد الذي يربط بين البروتينات المراعية للحديد. كذلك كان سبر الغشاء ميسوثيلين (مسلن)، بروتين الذي لا يتفاعل مع الحمض النووي الريبي. ب) أخذ تلطيخ جل بعد نقل البروتين، مما يدل على أن كميات متساوية من البروتينات كانت المحتضنة مع الحمض النووي الريبي تحقيقات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| مسبار الحمض النووي الريبي | التسلسل | تركيز |
| 25nt CALB2 3 ' UTR (ARE) | أوكجكوجواوجاووواجكووكواوج | 10 ميكرومتر |
| 25nt CALB2 3 ' UTR (متري) | أوكجكوجواوجوكوججكووكواوج | 10 ميكرومتر |
| لا علاقة لها الجيش الملكي النيبالي-28nt غضب | أوككوجكووكاكاجوجكووجاكجاك | 10 ميكرومتر |
الجدول 1 : تسلسل الحمض النووي الريبي يسبر
| المخزن المؤقت تريس أقل لتشغيل هلام | |
| 1.5 م | قاعدة تريس |
| 0.40 في المائة | حل الحزب الديمقراطي الصربي |
| أدجوست الأس الهيدروجيني إلى 8.8 استخدام HCL (6 مول/لتر) | |
| ملء مع | dH2O |
| تريس العلوي التراص هلام الحزب الديمقراطي الصربي صفحة | |
| 500 مم | قاعدة تريس |
| 0.4% | حل الحزب الديمقراطي الصربي |
| ضبط الأس الهيدروجيني إلى 6.8 استخدام HCL (6 مول/لتر) | |
| ملء مع | dH2O |
| 10 × تشغيل المخزن المؤقت | |
| 250 ملم | قاعدة تريس |
| 1.92 م | جليكاين |
| ضبط الأس الهيدروجيني إلى 8.3 استخدام HCL (6 مول/لتر) | |
| ملء مع | dH2O |
| عامل التصفية أو اﻷوتوكﻻف ومخزن عند 4 درجة مئوية | |
| المخزن المؤقت 1 "العاشر على التوالي" | |
| 100 مل | 10 × تشغيل المخزن المؤقت |
| 0.05% | حل الحزب الديمقراطي الصربي |
| ملء يصل إلى 1 لتر مع | dH2O |
| 10 × نقل المخزن المؤقت | |
| 480 مم | قاعدة تريس |
| 390 ملم | جليكاين |
| 0.38% | حل الحزب الديمقراطي الصربي |
| ملء مع | dH2O |
| ملاحظة: تصفية 0.22 أم وتخزينها في 4 درجات مئوية | |
| 1 X نقل المخزن المؤقت (لنظام شبه الجاف) | |
| 20 مل | 10 × نقل المخزن المؤقت |
| 40 مل | ميثانول |
| ملء يصل إلى 200 مل | dH20 |
| 10 X تبس (تريس مخزنة المالحة) | |
| 250 ملم | قاعدة تريس |
| 1.36 م | كلوريد الصوديوم |
| 27 مم | بوكل |
| ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.4 | |
| ملء مع | dH2O |
| عامل التصفية | |
| 1 X تتبس (المخزن المؤقت تريس المحلول الملحي مع توين 0.1-20) | |
| 1 X | 10 X TBS |
| 0.10 في المائة | 20-توين |
| ملء مع | dH2O |
| المخزن المؤقت للالتقاط الحمض النووي الريبي (1 X) | |
| 20 مم | تريس (درجة الحموضة 7.5) |
| م 1 | كلوريد الصوديوم |
| 1 مم | يدتا |
| ملزمة البروتين-الجيش الملكي النيبالي المخزن المؤقت (10 x) | |
| 200 ملم | تريس (درجة الحموضة 7.5) |
| 500 مم | كلوريد الصوديوم |
| 20 مم | MgCl2 |
| 1% | 20-توين |
| أغسل المخزن المؤقت (س 1) | |
| 20 مم | تريس (درجة الحموضة 7.5) |
| 10 ملم | كلوريد الصوديوم |
| 0.1% | 20-توين |
| شطف المخزن المؤقت | |
| 4 مم | بيوتين |
| 20 مم | تريس (درجة الحموضة 7.5) |
| 50 مم | كلوريد الصوديوم |
| الحل أخذ | |
| 0.02% | أخذ G-250 |
| 5% | الومينيومسولفاتي-(14-18)-هيدرات |
| 10 ٪ | EtOH |
| 2% | حمض اورثو الفوسفوريك |
الجدول 2: وصفات
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3 ' تحيلها تنتمي إلى الجينوم غير الترميز3، والكشف غير ترميز كافة يمكن أن تتفاعل مع البروتينات لممارسة هذه الوظيفة7. عندما وجد أن تكون نسخها شوهها الجينوم الثدييات وتنتج جزءا كبيرا من وقت طويل فضله الكشف16، الناشئة الأدلة أثبتت أن هذه الكشف الطويل فضله تعمل في تنظيم التعبير الجيني كما أنها تتفاعل مع إعادة عرض الكروماتين مجمعات17. واكتسبت هذه المعرفة باستخدام تحليل الحمض النووي الريبي المنسدلة. وهكذا، لبدء فك رموز التمثيلات الحمض النووي الريبي محددة، الخطوة الأولى يمكن أن تكون في المختبر فحوصات الكيمياء الحيوية مثل الحمض النووي الريبي-المنسدلة، كما أنها بسيطة لتنفيذ.
من المذكرة، يلعب زخارف التسلسل ليس فقط، بل أيضا بنية الحمض النووي الريبي الثانوية دوراً حاسما في الجيش الملكي النيبالي وظيفة كما أنها تشكل مجالات أساسية للتفاعل مع البروتينات. يمكن أن تختلف هيكل الثانوية في الفسيولوجية وقد تؤدي الظروف في المختبر ، والجيش الملكي النيبالي-المنسدلة لتحديد فالسيبوسيتيفيس. على سبيل المثال، حدد المنسدلة الجيش الملكي النيبالي EZH2، مكون من بوليكومب القمعية المعقدة 2 (PRC2)، إينتيراكتور من X نسخة محددة غير نشط (زيست)18، بينما دراسة أجريت مؤخرا أن استخدام العقاقير تنقية الحمض النووي الريبي مقترنة بالكتلة قياس الطيف الكتلي (الراب-MS) حددت التمثيلات الأخرى مثل شارب (SMRT وهداك المرتبطة قامع البروتين)، القوات المسلحة السودانية-1 (سقالة مرفق عامل A) وليبيريا (مستقبلات باء أمين)19. ولذلك، إذا لم الاختبارات الوظيفية الأخرى دعم التفاعل بين الجيش الملكي النيبالي وبروتين معين، النتائج التي توصل إليها ينبغي كذلك استكمال مع نهج المرتكزة على بروتين تكميلية، مثل إيمونوبريسيبيتاتينج بروتين معين، متبوعاً باستخراج و وصف الجيش الملكي النيبالي منضم.
هنا قد استخدم بروتوكول قدم للكشف عن هور ملزمة لفكرة هي في CALB2 3 ' UTR، الذي سبق وظيفيا اتسمت ب مقايسة بميرجلو-لوسيفراس6. نظراً لكمية صغيرة من البروتينات، هذا البروتوكول ليست مناسبة لتحليل المتلقين للمعلومات مثل قياس الطيف الكتلي يلزم فيها كميات أكبر من البروتين. بدلاً من ذلك، يمكن استخدام البروتوكول إعادة التحقق من صحة الجيش الملكي النيبالي التمثيلات حددها الكتلي، ولكن استخدام كمية أقل بكثير من البروتينات.
نظراً للأسلوب الذي يتضمن العمل مع الجيش الملكي النيبالي، وعرضه للتدهور، نوصي بتنظيف أسطح العمل مع حل رناسي تطهيرها بالإضافة إلى الممارسة الجيدة في المختبر القياسية. إذا كان ذلك ممكناً، القيام بإعداد تصنيف الحمض النووي الريبي وتنقية تحت الاندفاق الصفحي. نقاء اليغو الحمض النووي الريبي قد تؤثر أيضا على شروط ملزمة؛ وهكذا، كانت تحقيقات المركب تجارياً [هبلك] تنقية. وإذا لزم أوليجوس الحمض النووي الريبي المعدل وأطول ونقية جداً، استخدم الأسلوب تنقية صفحة. تحضير مختبرين للبروتينات الأصلية بالأداة التجميد، وبالتالي تجنب إلحاق الضرر بالبروتينات بسبب نهج التجميد البطيء وتكرار تجميد والغاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
بتأييد هذا العمل بالمنحة السويسرية سينيرجيا مؤسسة العلوم الوطنية CRSII3 147697 für ستيفتونغ كريبسفورشونج أنجيواندتي وكريبسليجا Zürich.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction kit | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free | Thermo Fisher Scientific | A32965 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit | Thermo Fisher Scientific | 20164 | Includes magnetic beads and therefore the kit need to be stored at 4 °C |
| Pierce RNA 3’ End Desthiobiotinylation Kit | Thermo Fisher Scientific | 20163 | The kit is a part of the "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit", and needs to be stored at -20 °C unlike the pull-down kit (4 °C). |
| DynaMag-2, magnetic stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Anti - HuR (MOUSE) monoclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | - | The antibody is included in the Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit - 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti - α - tubulin (MOUSE) monoclonal antibody | Santa Cruz | 8035 | 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti - PARP (RABBIT) Polyclonal antibody | Cell Signaling | 9542 | 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti - Mesothelin (MOUSE) Monoclonal Antibody | Rockland | 200-301-A87 | |
| Secondary goat anti-rabbit antibody | Cell Signaling | 7074 | |
| Secondary rabbit anti-mouse antibody | Sigma-Aldrich | A-9044 | |
| RPMI - 1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| FBS - Filtrated Bovine Serum | Pan Biotech | P40-37500 | |
| Penicillin - streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| L-Glutamine solution (200 mM) | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life technologies | 25200-056 | |
| Mini-PROTEAN 3 Cell | Bio-Rad | 1653301 | |
| Mini Protean System Glass Plates | Bio-Rad | 1653308 | |
| Mini-PROTEAN Spacer Plates with 1.5 mm integrated spacer | Bio-Rad | 1653312 | |
| Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1.5 mm, 66 µL | Bio-Rad | 1653365 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules | Bio-Rad | 1658050 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Rotiphorese gel 30 - aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ration of 37.5:1 | Roth | 3029 | |
| 20% SDS | PanReac AppliChem | A3942 | |
| PVDF transfer membrane | Perkin Elmer | NEF1002 | Need to be activated by incubating in pure methanol for 1 min followed by washing in water for 2 min |
| Trans-Blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio-Rad | 1705061 | |
| FusionFX Digital Imager | Vilber | - | |
| RNA oligo synthesis | Mycrosynth AG, Switzerland | - | the synthesis scale - 0.04 µmol - HPLC purified |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Hydrochloric Acid (HCl) 6 M | PanReac AppliChem | 182883.1211 | |
| Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15567027 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | 50% sterile aliquots to be stored at -20°C |
| Pierce Streptavidin magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 88817 | Please note that these magnetic beads have an average diameter of 1 µm (range from 0.5 - 1.5 µm). Furthermore, Dynabeads-M280 Streptavidin, which are beads of homogenouse size 2.8 µm, are also used in RNA-pulldown but be aware that this may affect purification process. |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Coomassie G-250 | Applichem | A3480 | |
| Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate | Sigma-Aldrich | 368458 | |
| ortho-phosphoric acid | Applichem | A0637 |
References
- Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Letters. 582 (14), 1977-1986 (2008).
- Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs. Trends in Cell Biology. 26 (3), 227-237 (2016).
- Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA Biology. 9 (5), 563-576 (2012).
- von Roretz, C., Di Marco, S., Mazroui, R., Gallouzi, I. E. Turnover of AU-rich-containing mRNAs during stress: a matter of survival. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 2 (3), 336-347 (2011).
- Fallmann, J., Sedlyarov, V., Tanzer, A., Kovarik, P., Hofacker, I. L. AREsite2: An enhanced database for the comprehensive investigation of AU/GU/U-rich elements. Nucleic Acids Research. 44, D90-D95 (2016).
- Kresoja-Rakic, J., et al. Posttranscriptional regulation controls calretinin expression in malignant pleural mesothelioma. Frontiers in Genetics. 8 (70), (2017).
- Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (1), 29-35 (2015).
- Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clinical Chemistry. 37 (5), 625-636 (1991).
- Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
- Thermo Scientific. Magnetic bead technology for better assay development. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/1602577-Magnetic-Bead-Technology-Brochure.pdf (2013).
- Usami, N., et al. Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients. Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Coulson, R. M., Cleveland, D. W. Ferritin synthesis is controlled by iron-dependent translational derepression and by changes in synthesis/transport of nuclear ferritin RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (16), 7613-7617 (1993).
- Leibold, E. A., Munro, H. N. Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated region of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (7), 2171-2175 (1988).
- Srikantan, S., Gorospe, M. HuR function in disease. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 17, 189-205 (2012).
- Morris, K. V., Mattick, J. S.
- Rinn, J. L., et al. Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs. Cell. 129 (7), 1311-1323 (2007).
- Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome. Science. 322 (5902), 750-756 (2008).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
