Desthiobiotin-streptividin-affinitet medierad rening av RNA-interagera proteiner i mesoteliom celler

Summary

Desthiobiotin märkning av en syntetisk 25-nukleotid RNA oligo, som innehåller en adenin-rika element (är) motiv, tillåter specifika bindningen av cytosoliska är-bindande protein.

Abstract

I in vitro- RNA-pulldown används fortfarande i stor utsträckning i de första stegen av protokoll som syftar till att identifiera RNA-bindande proteiner som känner igen specifika RNA strukturer och motiv. I detta RNA-pulldown protokoll, kommersiellt syntetiskt RNA sonder är märkta med en modifierad form av biotin, desthiobiotin, på 3′ terminus av RNA strandar, som reversibelt binder till streptividin och därmed tillåter eluering av proteiner under mer fysiologiska villkor. Den RNA-desthiobiotin är orörlig genom interaktion med streptividin på magnetiska pärlor, som används för att dra ner proteiner som specifikt interagerar med RNA av intresse. Icke-denaturerat och aktiva proteiner den cytosoliska delen av mesoteliom celler används som källa för proteiner. Den metod som beskrivs här kan användas för att upptäcka samspelet mellan kända RNA-bindande proteiner och en 25-nukleotid (nt) lång RNA sond som innehåller en sekvens av intresse. Detta är användbart att slutföra funktionell karakterisering av stabiliserande eller destabiliserande element i RNA-molekyler som uppnåtts med en reporter vector analys.

Introduction

Genuttryck och den slutliga nivån av produktens genen kan tätt regleras som påverkar mRNA-stabilitet och mRNA översättning hastighet¹. Dessa post-transcriptional regleringsmekanismer utövas genom samspelet mellan icke-kodande RNA och/eller RNA-bindande proteiner (RBPs) med riktade mRNA. Det är oftast 3′ oöversatta regionen av mRNA (3′ UTR – som hör till den icke-kodande delen av genomet²) som innehåller specifika cis-reglerande element (CRE), som erkänns av trans-agerar faktorer såsom miRNA eller RBPs ³. de bäst studerade cis-element inom den 3′ UTR, är adenin-rika element (är) motivet, som är erkänd av specifika AU-bindande proteiner (AUBP), och, i sin tur, inducerar antingen mRNA nedbrytning/deadenylation (är-medierad decay) eller mRNA stabilisering⁴.

Storleken av de 3′ UTR av calretinin mRNA (CALB2) är 573 bp lång och innehåller en förmodad AUUUA pentamer, som förutspådde av AREsite2, en bioinformatiska verktyg⁵. Konsekvent med förekomsten av en förmodad är motiv, pmirGLO vector-reporter analysen visade en stabilisering roll av detta element inom CALB2 mRNA⁶. Slutligen den in vitro- RNA-pulldown användes för att identifiera de AUBP som stabiliserar calretinin mRNA genom är motivet.

Eftersom alla icke-kodande RNAs interagerar med proteiner⁷, är av in vitro- RNA-pulldown ett bra sätt och första-av-val analys för att identifiera RNA-interactmedlemmar till stöd i dechiffrera molekylära mekanismer. I denna RNA-pulldown metod användes kommersiellt syntetiskt RNA-sonder, som var märkt med en modifierad form av biotin (desthiobiotin) på 3′ terminus av RNA strandar. Den RNA-desthiobiotin är orörlig genom interaktion med streptividin på magnetiska pärlor, som används för att dra ner proteiner som specifikt interagerar med bundna-RNA av intresse. Icke-denaturerat och aktiva proteiner den cytosoliska delen av mesoteliom celler används som källa för proteiner. Sådant RNA-bundna proteiner elueras från de magnetiska pärlor, kör genom en gel med 12% i SDS-PAGE, överförs till ett membran och utforskad med olika antikroppar.

I förfarandet standard streptividin-biotin affinitet rening, hårda denaturering villkor krävs för att störa den starka irreversibel biotin-streptividin obligationen för att eluera den bundna proteiner⁸, vilket kan leda till dissociationen av proteinkomplex. Till skillnad från biotin, desthiobiotin reversibelt binder till streptividin och förflyttas konkurrenskraftigt med en buffrad lösning av biotin, möjliggör den milda elueringen av proteiner, och undvika isolering av naturligt biotinylerade molekyler⁹, tyder på att tekniken är idealisk för att isolera infödda proteinkomplex under inhemska förhållanden.

In vitro bindande villkor och stringens, vilka bestäms av salt koncentration, reduktionsmedel och tvättmedel procentandel, bör vara nära de närvarande i cellulära samband för att identifiera sant i vivo interaktioner. De bindande villkor genomförts häri har tidigare påvisats lämpligt för identifiering av HuR som en AU-bindande protein¹⁰. Detta synsätt skulle kunna spara tid, eftersom optimering av ordentlig bindande villkor kan vara tidskrävande och utmanande. Dessutom, denna metod skulle kunna användas som ett start protokoll för alla RNA-pulldown experiment och gradvis kan optimeras genom att ändra koncentrationen av salter och rengöringsmedel, ändra procentandelen glycerol och lägga till andra salter. Dessutom har vi visat att även en kort 25-nukleotid RNA-probe härbärgerat en pentamer är-motiv kunde användas att demonstrera interaktion med en specifik AUBP.

Protocol

1. beredning av cytosoliska och nukleära proteinfraktion Plåt 4 x 106 ACC-MESO-4 celler i en T150 cell kultur kolv odlas i RPMI – 1640 medium kompletteras med 10% FBS, 1 x penicillin/streptomycin (100 x) och 2 mM L-glutamin (200 mM). När celler når en sammanflödet av 80-90% (~5-5.5 x 106 celler), Fortsätt med protein utvinning av kärn- och cytosoliska bråkdel.Obs: ACC-MESO-4 cell fodrar erhölls från RIKEN BioResource centrum11. Aspirera mediu…

Representative Results

I detta experiment användes ett 25-nt långt fragment av calretinin 3′ UTR hysande är motiv (CALB2 3′ UTR (är) 25-nt) för att testa om det binder specifikt till proteinet mänskliga-antigen R (HuR), en känd mRNA-stabilisator. För att testa specificiteten av elementet är, en 25-nt-RNA var sonden CALB2 3′ UTR (mtARE) som innehåller en mutation som är-motiv, som tidigare visades att avskaffa stabilisering effekten av är motivet, används6. Den tredje RNA pro…

Discussion

3′ utr hör till den icke-kodande genom³, och alla icke-kodande RNAs kan interagera med proteiner för att utöva sin funktion⁷. När däggdjur genomet befanns pervasively transkriberas och produceras en betydande del av långa icke-kodande RNAs¹⁶, visat framväxande bevis att dessa lång-kodande RNAs fungera i reglerar genuttryck som de interagerar med kromatin-remodeling komplex¹⁷. Denna kunskap fick utnyttja RNA-pulldown an…

Materials

NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction kit	Thermo Fisher Scientific	78833
Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free	Thermo Fisher Scientific	A32965
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23225
Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit	Thermo Fisher Scientific	20164	Includes magnetic beads and therefore the kit need to be stored at 4 °C
Pierce RNA 3’ End Desthiobiotinylation Kit	Thermo Fisher Scientific	20163	The kit is a part of the "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit", and needs to be stored at -20 °C unlike the pull-down kit (4 °C).
DynaMag-2,  magnetic stand	Thermo Fisher Scientific	12321D
Anti – HuR (MOUSE) monoclonal antibody	Thermo Fisher Scientific	–	The antibody is included in the Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit  – 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS
Anti – α – tubulin (MOUSE) monoclonal antibody	Santa Cruz	8035	1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS
Anti – PARP (RABBIT) Polyclonal antibody	Cell Signaling	9542	1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS
Anti – Mesothelin (MOUSE) Monoclonal Antibody	Rockland	200-301-A87
Secondary goat anti-rabbit antibody	Cell Signaling	7074
Secondary rabbit anti-mouse antibody	Sigma-Aldrich	A-9044
RPMI – 1640 medium	Sigma-Aldrich	R8758
FBS – Filtrated Bovine Serum	Pan Biotech	P40-37500
Penicillin – streptomycin (100x)	Sigma-Aldrich	P4333
L-Glutamine solution (200 mM)	Sigma-Aldrich	G7513
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco by Life technologies	25200-056
Mini-PROTEAN 3 Cell	Bio-Rad	1653301
Mini Protean System Glass Plates	Bio-Rad	1653308
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 1.5 mm integrated spacer	Bio-Rad	1653312
Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1.5 mm, 66 µL	Bio-Rad	1653365
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules	Bio-Rad	1658050
RNaseZap RNase Decontamination Solution	Thermo Fisher Scientific	AM9780
Rotiphorese gel 30 – aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ration of 37.5:1	Roth	3029
20% SDS	PanReac AppliChem	A3942
PVDF transfer membrane	Perkin Elmer	NEF1002	Need to be activated by incubating in pure methanol for 1 min followed by washing in water for 2 min
Trans-Blot SD semi-dry transfer cell	Bio-Rad	1703940
Clarity Western ECL Substrate	Bio-Rad	1705061
FusionFX  Digital Imager	Vilber	–
RNA oligo synthesis	Mycrosynth AG, Switzerland	–	the synthesis scale – 0.04 µmol – HPLC purified
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7030
Hydrochloric Acid (HCl) 6 M	PanReac AppliChem	182883.1211
Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5	Thermo Fisher Scientific	15567027
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	17904	50% sterile aliquots to be stored at -20°C
Pierce Streptavidin magnetic beads	Thermo Fisher Scientific	88817	Please note that these magnetic beads have an average diameter of 1 µm (range from 0.5 – 1.5 µm). Furthermore, Dynabeads-M280 Streptavidin, which are beads of homogenouse size 2.8 µm, are also used in RNA-pulldown but be aware that this may affect purification process.
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Coomassie G-250	Applichem	A3480
Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate	Sigma-Aldrich	368458
ortho-phosphoric acid	Applichem	A0637