前庭と聴覚の感覚器官の三次元切片培養
1Department of Stem Cell Biology and Regenerative Medicine,Keck School of Medicine of the University of Southern California, 2Caruso Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery,Keck School of Medicine of the University of Southern California, 3Howard Hughes Medical Institute and Laboratory of Sensory Neuroscience,The Rockefeller University
Summary
三次元切片培養マウス卵形嚢との蝸牛は光学的コラーゲン ゲル保持する生得的な組織形態の私をオフに、マトリックス剛性の調整により機械的刺激を可能にするおよびウイルス媒介性遺伝子配信を許可します。
Abstract
内耳の感覚器官は、実験操作と光学観測にその到達不能のための哺乳類の研究に挑戦しています。また、既存の培養技術は生化学的摂動ことは、これらのメソッドが、内耳感覚的な器官の開発中に機械的な力と組織剛性の効果を検討するための手段を提供しません。ここでそのままマウス卵形嚢とこれらの制限を克服して蝸牛の三次元培養法について述べる。ここで説明した三次元マトリックス剛性の調整法は、弾性組織の成長に反対の操作を許可します。このメソッドは、内耳開発中に機械的な力の役割を研究するため使用できます。さらに、文化は、利得と損失-の機能実験に使用することができますウイルス媒介性遺伝子配信を許可します。この培養法は、生来の有毛細胞を保持され、支持細胞し前庭と聴覚の感覚器官の伝統的な二次元文化を代替する可能性のある優れた役割を果たします。
Introduction
哺乳類の器官形成のほとんどの面の研究は、生体外でシステムによって促進されています。2 つの主な方法は今前庭感覚的な器官の培養用: 浮遊1と付着性2準備。両方のメソッドは、有毛細胞の脆弱性3と再生1,4 の生体外の調査を許可します。さらに、ノッチ5,6, Wnt7、8、上皮成長因子受容体 (EGFR)9,10内耳のカスケードをシグナル伝達の発達の役割があります。確立されて、一部、感覚上皮の体外培養を使用しています。しかし、細胞の成長と分化制御、細胞間の連絡先など物理的、機械的な手がかりにも介してモルフォゲン シグナル伝達細胞外マトリックスの剛性と機械的伸張または収縮だけではなく。このような機械的刺激の役割は、発展途上の内耳の生体内で調査するは困難です。また、既存の浮遊・付着性文化メソッドはこのような研究の培養に適してではありません。ここで述べるコラーゲンの三次元培養のため私はゲルのさまざまな剛性。このメソッドは主前庭と蝸牛の感覚器官の生体内でアーキテクチャを保持され、により、増殖・分化11機械力の影響の検討。
力学的刺激は、シグナリング経路12,13,14,15、カバなどの下流の分子イベントをアクティブにする知られているので機械的刺激を組み合わせることができることが重要です。生化学的および遺伝的操作。ここで説明した培養法は、ウイルスを介する遺伝子導入を可能し、内耳開発11時両方の機械的および分子伝達を研究するためすることができます。
Protocol
ここで説明したすべてのメソッドは、動物のケアおよび使用委員会のロックフェラー大学と南カリフォルニア大学に承認されています。 1 (コラーゲンのオプション) 準備私 Mouse-tail 腱からソリューション 注:コラーゲン私ソリューション、商業的に利用できます。ゲルの準備のための製造元の指示に従ってください。 <sup class="xref"…
Representative Results
胚の耳から前庭と聴覚の感覚器官はマイク低剛性萌芽期の条件11を模倣したゲル 40 Pa コラーゲン培養、比較的普通の三次元構造 (図 1) を保ち、有毛細胞を維持し、支持細胞 (図 2および図 3)。30% 以上減少する細胞密度をサポート (スチューデントのt検定: n = 4、 p < 0.004) ?…
Discussion
仲介する成長と開発時に内耳に分化されている分子信号は盛んに5,6,7,8,9,10。ただし、小嚢のモデル システムから得られる証拠は、セル接合とカバがシグナル伝達の活性化を通した感覚の機械の手がかりがこれらプロセス2,<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロトコルの基になる元の研究への貢献、博士 A. ドンハコボラーナー、博士 j. サルヴィと A. Petelski に感謝します。また技術支援および動物飼育のため j. ラマと・ w ・ Makmura に感謝我々。我々 は NIDCD グラント R01DC015530、ロバートソン治療開発資金と資金・ カルーソ家族財団 NIDCD トレーニンググラントは T32 DC009975 を認めます。最後に、我々 は、ハワード ヒューズ医学研究所、博士ハズペスは捜査官からのサポートを認めます。
Materials
| #10 Surgical Blades | Miltex | 4-110 | |
| #5 Forceps | Dumont | 11252-20 | |
| 100 mm Petri dish | Sigma | P5856-500EA | |
| 250 uL large orifice pipette tips | USA Scientific | 1011-8406 | |
| 30 mm glass-bottom Petri dish | Matsunami Glass USA Corporation | D35-14-1.5-U | |
| 4 well plate | Thermo Fisher Scientific | 176740 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H7904 | |
| 60 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | 123TS1 | |
| Acetic acid | Sigma | 537020 | |
| Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Anti-GFP, chicken IgY fraction | Invitrogen | A10262 | |
| Anti-Myo7A | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Anti-Sox2 Antibody (Y-17) | Santa Cruz | sc-17320 | |
| Bicinchoninic acid assay | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10340 | |
| Collagenase I | Gibco | 17100017 | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F5392 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Glutamine | Sigma | G8540 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| Hemocytometer | Daigger | EF16034F | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Iridectomy scissors | Zepf Medical Instruments | 08-1201-10 | |
| Microinjector | Narishige | IM-6 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Gibco | 70011044 | |
| PBS (1X), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Phenol Red pH indicator | Sigma | P4633 | |
| Pure Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
| RFP antibody | ChromoTek | 5F8 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Tabletop vortex | VWR | 97043-562 | |
| Transferrin | Sigma | T8158 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 |
References
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Cite This Article
Gnedeva, K., Hudspeth, A. J., Segil, N. Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs. J. Vis. Exp. (136), e57527, doi:10.3791/57527 (2018).