Ex वीवो Normothermic लिवर छिड़काव का एक छोटा सा एनिमल मॉडल
Summary
वहां एक महत्वपूर्ण जिगर दाता की कमी है, और जिगर दाताओं के लिए मानदंड का विस्तार किया गया है । Normothermic ex vivo जिगर छिड़काव (NEVLP) का मूल्यांकन और अंग समारोह को संशोधित करने के लिए विकसित किया गया है. यह अध्ययन NEVLP के एक चूहे के मॉडल को दर्शाता है और pegylated-catalase की क्षमता का परीक्षण करता है, जिगर संरक्षण चोट को कम करने के लिए ।
Abstract
प्रत्यारोपण के लिए उपलब्ध जिगर allografts की एक महत्वपूर्ण कमी है, और जवाब में दाता मानदंड का विस्तार किया गया है । नतीजतन, normothermic पूर्व vivo जिगर छिड़काव (NEVLP) के मूल्यांकन और अंग समारोह को संशोधित करने के लिए एक विधि के रूप में पेश किया गया है । NEVLP hypothermic और subnormothermic छिड़काव की तुलना में कम संरक्षण चोट सहित कई फायदे हैं, शारीरिक स्थितियों के तहत सामांय अंग समारोह की बहाली, अंग प्रदर्शन के आकलन, और अंग की मरंमत के लिए एक मंच के रूप में , रिमॉडलिंग, और संशोधन । दोनों murine और सुअर का NEVLP मॉडल बताए गए हैं । हम NEVLP के एक चूहे के मॉडल का प्रदर्शन और इस मॉडल का उपयोग करने के लिए अपने महत्वपूर्ण आवेदनों में से एक-एक चिकित्सीय अणु का उपयोग दिखाने के जिगर perfusate को जोड़ा । Catalase एक अंतर्जात प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) मेहतर है और ischemia कमी करने के लिए प्रदर्शन किया गया है-आंख, मस्तिष्क, और फेफड़ों में reperfusion । Pegylation को endothelium के catalase को टारगेट करते दिखाया गया है । यहां, हम pegylated-catalase (खूंटी बिल्ली) के आधार perfusate को जोड़ा और अपनी जिगर संरक्षण चोट को कम करने की क्षमता का प्रदर्शन किया । हमारे मूषक NEVLP मॉडल का एक लाभ यह है कि यह बड़ा पशु मॉडलों की तुलना में सस्ती है । इस अध्ययन की एक सीमा है कि यह वर्तमान में पोस्ट छिड़काव जिगर प्रत्यारोपण शामिल नहीं है । इसलिए, अंग पद प्रत्यारोपण के समारोह की भविष्यवाणी निश्चितता के साथ नहीं किया जा सकता है । हालांकि, चूहे जिगर प्रत्यारोपण मॉडल अच्छी तरह से स्थापित है और निश्चित रूप से इस मॉडल के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । अंत में, हम एक सस्ती, सरल, आसानी से replicable NEVLP चूहों का उपयोग कर मॉडल का प्रदर्शन किया है । इस मॉडल के अनुप्रयोगों के परीक्षण उपन्यास perfusates और perfusate additives शामिल कर सकते हैं, अंग मूल्यांकन के लिए बनाया गया परीक्षण सॉफ्टवेयर, और अंगों की मरंमत करने के लिए डिज़ाइन प्रयोग ।
Introduction
वहां जिगर प्रत्यारोपण के लिए प्रतीक्षा सूची पर १४,५७८ रोगियों और लगभग ७,००० प्रत्यारोपण कर रहे है प्रति वर्ष प्रदर्शन कर रहे है1,2। इस महत्वपूर्ण दाता की कमी के जवाब में, जिगर दाताओं के लिए मानदंड का विस्तार किया है; ये अक्सर सीमांत अंगों या विस्तारित मानदंड दाताओं के रूप में जाना जाता है और कम अच्छी तरह से मानक मानदंड allografts से प्रत्यारोपण के बाद, प्राथमिक भ्रष्टाचार शिथिलता और विलंबित भ्रष्टाचार3समारोह की उच्च दर के साथ प्रदर्शन की उंमीद कर रहे हैं, 4,5,6. नतीजतन, NEVLP एक विधि के रूप में मूल्यांकन और अंग6,7को संशोधित करने के लिए शुरू किया गया है । हम NEVLP के एक चूहे मॉडल तैयार किया है और इस मॉडल का इस्तेमाल अपने महत्वपूर्ण संभावित आवेदनों में से एक का प्रदर्शन-उपंयास अणु additives के जिगर perfusate को परीक्षण ।
NEVLP दोनों murine (चूहा) और सुअर का मॉडल में मूल्यांकन किया गया है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में त्याग मानव अंगों में6,8,9। NEVLP के प्रथम मानव परीक्षणों के परिणाम भी हाल ही में१०प्रकाशित हुए हैं. हालांकि hypothermic मशीन छिड़काव स्पष्ट रूप से गुर्दे के संरक्षण के लिए मानक बन गया है, जो तापमान पर जिगर की मशीन छिड़काव होना चाहिए अभी भी विवादास्पद है । NEVLP hypothermic और subnormothermic छिड़काव की तुलना में कई प्रस्तावित लाभ है । ये कम संरक्षण चोट शामिल हैं, शारीरिक स्थितियों के तहत सामांय अंग समारोह की बहाली, अंग प्रदर्शन का आकलन करने की क्षमता, और अंग की मरंमत के लिए एक मंच के रूप में, remodeling, और संशोधन7,11, 12,13,14,15,16,17.
सुअर का NEVLP मॉडलों का प्रयोग करते हुए काफी संख्या में अध्ययन पूरा किया गया है । हालांकि इन मॉडलों अपेक्षाकृत सस्ती कर रहे है जब मॉडल त्याग मानव अंगों या मानव नैदानिक परीक्षणों का उपयोग कर विचार, वे बहुत महंगे है जब हमारे छोटे जानवर NEVLP मॉडल की तुलना में । प्रति प्रयोग लागत का एक महत्वपूर्ण घटक perfusate है । हम एक अपेक्षाकृत कम कीमत पर perfusate के ३०० मिलीलीटर के साथ एक 4 एच छिड़काव पूरा करने में सक्षम हैं । इसके अतिरिक्त, चूहों सहित छोटे जानवरों की लागत सूअरों की लागत की तुलना में बहुत कम है.
चूहे में NEVLP के अंय मॉडलों की तुलना में, यहां प्रस्तुत मॉडल अपेक्षाकृत लागू करने के लिए सरल है और आवेदनों की एक व्यापक रेंज है । छिड़काव सर्किट चित्रा 1में देखा जा सकता है । perfusate perfusate जलाशय (1), जो एक पानी जैकेट कंटेनर है में शुरू होता है । Perfusate जलाशय से एक रोलर पंप द्वारा खींच लिया है (2) और एक windkessel (3) और फिर oxygenator (4) में धकेल दिया । oxygenator countercurrent गैस और perfusate प्रवाह के लिए अधिकतम गैस विनिमय प्रदान करने के लिए निर्धारित है । perfusate तो एक हीटिंग का तार करने के लिए आय (5) छिड़काव कक्ष के अंदर यह सुनिश्चित करने के लिए शारीरिक तापमान पर है, और एक बुलबुला जाल (6) हवा के बुलबुले के छिड़काव को रोकने के लिए वहां पूर्व अंग है (7) और बाद अंग (8) नमूना बंदरगाहों, जो perfusate की अनुमति नमूना. perfusate तो पोर्टल नस प्रवेशनी के माध्यम से जिगर में प्रवेश करती है । पोर्टल शिरा प्रवेशनी एक दबाव मॉनिटर है कि डेटा संग्रह सॉफ्टवेयर पर मानों चार्ट से जुड़ा हुआ है । perfusate तो IVC प्रवेशनी के माध्यम से जिगर से बाहर निकलता है और दबाव तुल्यकारक ब्लॉक (9) में बहती है । अंत में, perfusate रोलर पंप के माध्यम से दबाव ब्लॉक वापस से खींच लिया और जलाशय में खाली कर दिया है । इस मॉडल पोर्टल नस के लिए सतत छिड़काव शामिल है और यकृत धमनी और कुछ अंय मॉडलों में इस्तेमाल किया डायलिसिस के लिए गुणवाला प्रवाह बाहर छोड़ देता है, जिनमें से प्रत्येक एक अलग और अतिरिक्त सर्किट की आवश्यकता है, लेकिन पहले नहीं किया जा करने के लिए प्रदर्शन किया गया है आवश्यक९,१३.
perfusate के लिए एक उपंयास चिकित्सकीय अणु के अलावा का पता लगाने के लिए, हम एंजाइम catalase चुना है । Catalase एक अंतर्जात ROS मेहतर है कि कोशिकाओं का हिस्सा है आंतरिक सुरक्षा तंत्र ROS18के प्रभाव को कम करने के लिए । Catalase अभिव्यक्ति यकृत ischemia reperfusion चोट19में वृद्धि हुई है । catalase के प्रयोगात्मक इसके अलावा ischemia कम करने के लिए प्रदर्शन किया गया है-आंख, मस्तिष्क में reperfusion, और फेफड़ों20,21,22,23,24। Pegylation के लिए endothelium और catalase में endothelial कोशिकाओं में सहायता करने के लिए catalase लक्ष्य दिखाया गया है25। खूंटी-बिल्ली यकृत ischemia-reperfusion चोट को कम करने में सीमित प्रभावकारिता के साथ प्रणालीबद्ध प्रशासित किया गया है; हालांकि, हम एक अलग अंग छिड़काव सर्किट करने के लिए खूंटी-बिल्ली जोड़ने की कल्पना26,27,28में सुधार परिणाम के लिए नेतृत्व करेंगे । यहां, हम खूंटी-बिल्ली हमारे आधार perfusate को जोड़ने और अपनी क्षमता को कम करने जिगर संरक्षण चोट का प्रदर्शन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
वहां जिगर प्रत्यारोपण के लिए उपलब्ध allografts की एक महत्वपूर्ण कमी है और प्रतिक्रिया दाता मानदंड में1,2,3,4,5का विस्तार किया गया है । दाता की कमी के ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम NIH T32AI 106704-01A1 और अंग प्रत्यारोपण, फ़्लेश, इंजीनियरिंग और ओहियो राज्य विश्वविद्यालय में उत्थान के लिए छिड़काव कोष द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Perfusate | |||
| 8% Albumin | CLS Behring, King of Prussia, PA | 0053-7680-32 | |
| Williams Media | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | W1878 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | P4333 | |
| Insulin | Eli Lilly, Indianapolis, IL | 0002-8215-91 | |
| Heparin | Fresnius Lab, Lake Zurich, IL | C504701 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | G3126 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | H0888 | |
| THAM | Hospira, Inc, | 0409-1593-04 | |
| Polyethylene Glycol – Catalase | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
| Personal Protective Equipment | |||
| Surgical Mask | Generic | N/A | |
| Protective Gown | Generic | N/A | |
| Surgical Gloves | Generic | N/A | |
| Liver Procurement | |||
| Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 250 -350 grams | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | N/A | |
| Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
| Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
| Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
| Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
| SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
| Oxygen | Praxair | 98015 | |
| Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
| GenieTouch | Kent Scientific | GenieTouch | |
| Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
| 4×4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
| Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
| U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
| 5mL Syringe | BD | REF 309603 | |
| 4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
| 7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
| 16 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4252586-02 | |
| 14 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4251717-02 | |
| Bile Duct Cannular Tubing | Altec | 01-96-1727 | |
| Liver Perfusion Circuit Components | |||
| Water Bath Warmer | Lauda Ecoline Staredition | E103 | |
| Data Collection Software | ADInstruments | Labchart 7 | |
| Liver Perfusion Circuit | Harvard Apparatus | 73-2901 | |
| Membrane Oxygenator | Mediac SPA | M03069 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM827B | |
| Gas (95% oxygen and 5% carbon dioxide) | Praxair | 98015 | |
| Organ Chamber | Harvard Apparatus | ILP-2 | |
| 1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
| Mucasol | Sigma-Aldrich | Z637181 | |
| Microsurgical Instruments | |||
| Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
| Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
| Forceps – Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
| Forceps – Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
| Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
| Scissors – non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
| Forceps – Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
| Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
| Small Mosquito Clamps | Generic | N/A | |
| Post-Experiment Analysis | |||
| Alanine Aminotransferase (ALT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K752 | |
| Adenosine Triphosphate (ATP) Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K354 | |
| Glutathione Assay Kit | Cayman Chemical | 703002 | |
| Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit | Abcam | ab118970 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8090 | |
| POLARstar OMEGA Microplate Reader | BMG LABTECH | N/A |
References
- . National Data. Overall by Organ. Current U.S. Waiting List. Based on OPTN data as of October 19, 2017 Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov/data/view-data-reports/national-data/ (2017)
- . National Data, Transplants by Donor Type, U.S. Transplants Performed January 1, 1988 – December 31, 2016, For Organ = Liver Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov/data/view-data-reports/national-data/ (2017)
- Nemes, B., et al. Extended criteria donors in liver transplantation Part I: reviewing the impact of determining factors. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 827-839 (2016).
- Nemes, B., et al. Extended-criteria donors in liver transplantation Part II: reviewing the impact of extended-criteria donors on the complications and outcomes of liver transplantation. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 841-859 (2016).
- Pezzati, D., Ghinolfi, D., De Simone, P., Balzano, E., Filipponi, F. Strategies to optimize the use of marginal donors in liver transplantation. World J Hepatol. 7 (26), 2636-2647 (2015).
- Marecki, H., et al. Liver ex situ machine perfusion preservation: A review of the methodology and results of large animal studies and clinical trials. Liver Transpl. 23 (5), 679-695 (2017).
- Barbas, A. S., Knechtle, S. J. Expanding the Donor Pool With Normothermic Ex Vivo Liver Perfusion: The Future Is Now. Am J Transplant. 16 (11), 3075-3076 (2016).
- Dries, S., et al. Ex vivo normothermic machine perfusion and viability testing of discarded human donor livers. Am J Transplant. 13 (5), 1327-1335 (2013).
- Westerkamp, A. C., et al. End-ischemic machine perfusion reduces bile duct injury in donation after circulatory death rat donor livers independent of the machine perfusion temperature. Liver Transpl. 21 (10), 1300-1311 (2015).
- Selzner, M., et al. Normothermic ex vivo liver perfusion using steen solution as perfusate for human liver transplantation: First North American results. Liver Transpl. 22 (11), 1501-1508 (2016).
- Whitson, B. A., Black, S. M. Organ assessment and repair centers: The future of transplantation is near. World J Transplant. 4 (2), 40-42 (2014).
- Tolboom, H., et al. Subnormothermic machine perfusion at both 20°C and 30°C recovers ischemic rat livers for successful transplantation. J Surg Res. 175 (1), 149-156 (2012).
- Nagrath, D., et al. Metabolic preconditioning of donor organs: defatting fatty livers by normothermic perfusion ex vivo. Metab Eng. 11 (4-5), 274-283 (2009).
- Boehnert, M. U., et al. Normothermic acellular ex vivo liver perfusion reduces liver and bile duct injury of pig livers retrieved after cardiac death. Am J Transplant. 13 (6), 1441-1449 (2013).
- Schön, M. R., et al. Liver transplantation after organ preservation with normothermic extracorporeal perfusion. Ann Surg. 233 (1), 114-123 (2001).
- Reddy, S., et al. Non-heart-beating donor porcine livers: the adverse effect of cooling. Liver Transpl. 11 (1), 35-38 (2005).
- Banan, B., et al. Novel strategy to decrease reperfusion injuries and improve function of cold-preserved livers using normothermic ex vivo liver perfusion machine. Liver Transpl. 22 (3), 333-343 (2016).
- Held, P. . An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in Cells. , 1-14 (2012).
- Chen, C. F., et al. Reperfusion liver injury-induced superoxide dismutase and catalase expressions and the protective effects of N-acetyl cysteine. Transplant Proc. 39 (4), 858-860 (2007).
- Chen, B., Tang, L. Protective effects of catalase on retinal ischemia/reperfusion injury in rats. Exp Eye Res. 93 (5), 599-606 (2011).
- He, Y. Y., Hsu, C. Y., Ezrin, A. M., Miller, M. S. Polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase in focal cerebral ischemia-reperfusion. Am J Physiol. 265 (1 Pt 2), H252-H256 (1993).
- Işlekel, S., Işlekel, H., Güner, G., Ozdamar, N. Alterations in superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase activities in experimental cerebral ischemia-reperfusion. Res Exp Med (Berl). 199 (3), 167-176 (1999).
- Li, G., Chen, Y., Saari, J. T., Kang, Y. J. Catalase-overexpressing transgenic mouse heart is resistant to ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol. 273 (3 Pt 2), H1090-H1095 (1997).
- Nowak, K., et al. Immunotargeting of catalase to lung endothelium via anti-angiotensin-converting enzyme antibodies attenuates ischemia-reperfusion injury of the lung in vivo. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 293 (1), L162-L169 (2007).
- Beckman, J. S., et al. Superoxide dismutase and catalase conjugated to polyethylene glycol increases endothelial enzyme activity and oxidant resistance. J Biol Chem. 263 (14), 6884-6892 (1988).
- Yabe, Y., Nishikawa, M., Tamada, A., Takakura, Y., Hashida, M. Targeted delivery and improved therapeutic potential of catalase by chemical modification: combination with superoxide dismutase derivatives. J Pharmacol Exp Ther. 289 (2), 1176-1184 (1999).
- Yabe, Y., et al. Prevention of neutrophil-mediated hepatic ischemia/reperfusion injury by superoxide dismutase and catalase derivatives. J Pharmacol Exp Ther. 298 (3), 894-899 (2001).
- Ushitora, M., et al. Prevention of hepatic ischemia-reperfusion injury by pre-administration of catalase-expressing adenovirus vectors. J Control Release. 142 (3), 431-437 (2010).
- Kakizaki, Y., et al. The Effects of Short-Term Subnormothermic Perfusion after Cold Preservation on Liver Grafts from Donors after Cardiac Death: An Ex Vivo Rat Model. Transplantation. , (2018).
- Kumar, R., Chung, W. Y., Dennison, A. R., Garcea, G. Ex Vivo Porcine Organ Perfusion Models as a Suitable Platform for Translational Transplant Research. Artif Organs. , (2017).
- Nativ, N. I., et al. Liver defatting: an alternative approach to enable steatotic liver transplantation. Am J Transplant. 12 (12), 3176-3183 (2012).
- Yeung, J. C., et al. Ex vivo adenoviral vector gene delivery results in decreased vector-associated inflammation pre- and post-lung transplantation in the pig. Mol Ther. 20 (6), 1204-1211 (2012).
- Goldaracena, N., et al. Inducing Hepatitis C Virus Resistance After Pig Liver Transplantation-A Proof of Concept of Liver Graft Modification Using Warm Ex Vivo Perfusion. Am J Transplant. 17 (4), 970-978 (2017).
- Van Raemdonck, D., Neyrinck, A., Rega, F., Devos, T., Pirenne, J. Machine perfusion in organ transplantation: a tool for ex vivo graft conditioning with mesenchymal stem cells?. Curr Opin Organ Transplant. 18 (1), 24-33 (2013).
- Pratschke, S., et al. Results of the TOP Study: Prospectively Randomized Multicenter Trial of an Ex Vivo Tacrolimus Rinse Before Transplantation in EDC Livers. Transplant Direct. 2 (6), e76 (2016).
- Pratschke, S., et al. Protocol TOP-Study (tacrolimus organ perfusion): a prospective randomized multicenter trial to reduce ischemia reperfusion injury in transplantation of marginal liver grafts with an ex vivo tacrolimus perfusion. Transplant Res. 2 (1), 3 (2013).
- Nativ, N. I., et al. Elevated sensitivity of macrosteatotic hepatocytes to hypoxia/reoxygenation stress is reversed by a novel defatting protocol. Liver Transpl. 20 (8), 1000-1011 (2014).
- Lonze, B. E., et al. In vitro and ex vivo delivery of short hairpin RNAs for control of hepatitis C viral transcript expression. Arch Surg. 147 (4), 384-387 (2012).
