Een Drosophila In Vivo letsel Model voor het bestuderen van de Neuroregeneration in de perifere en centrale zenuwstelsel

Summary

Hier presenteren we een protocol met de Drosophila sensorisch neuron – dendritische arborization (da) neuron letsel model, dat in vivo combineert wonen imaging, twee-foton laser axotomy/dendriotomy en de krachtige vliegen genetische werkset, als een platform voor de screening potentiële initiatiefnemers en remmers van neuroregeneration.

Abstract

De capaciteit van de hergroei van beschadigde neuronen regelt neuroregeneration en functionele herstel na trauma van het zenuwstelsel. In de afgelopen decennia, zijn verschillende intrinsieke en extrinsieke remmende factoren die betrokken zijn bij de beperking van axon regeneratie geïdentificeerd. Gewoon verwijderen van deze remmende signalen is echter onvoldoende is voor de succesvolle regeneratie, met vermelding van het bestaan van aanvullende regelgevende machines. Drosophila melanogaster, de fruitvlieg, deelt evolutionair geconserveerde genen en signaalroutes met gewervelde dieren, inclusief de mens. Combineert de krachtige genetische werkset van vliegen met twee-foton laser axotomy/dendriotomy, beschrijven wij hier de Drosophila sensorisch neuron-dendritische arborization (da) neuron letsel model als een platform voor het systematisch screenen voor roman regeneratie regelgevers. Kortom, dit paradigma omvat a) de voorbereiding van de larven, b) laesie inductie dendrite(s) of axon(s) met behulp van een twee-foton laser, c) live confocal imaging na analyse schade en d) gegevens. Ons model kan zeer reproduceerbare verwonding van enkele gelabelde neuronen, axonen en dendrites van welomschreven neuronale subtypes, in zowel de perifere en centrale zenuwstelsel.

Introduction

Het onvermogen van axonen te regenereren na een letsel aan het centrale zenuwstelsel (CNS), kan leiden tot permanente handicaps in patiënten, en speelt ook een rol in de onomkeerbare neurologische tekorten in neurodegeneratieve ziekten^{1,2 ,3,4,5}. De CNS-milieu, alsmede het groeivermogen van de intrinsieke van neuronen, bepaalt of axonen zijn in staat om te regenereren na trauma. Extracellulaire factoren uit Oligodendrocyt, astroglial en fibroblastic bronnen is aangetoond dat het bemoeilijken van de neuronale groei^4,,^6,,^7,8, maar de afschaffing van deze moleculen alleen voorziet in beperkte kiemen van⁵. Regeneratie van de intrinsieke signalen kunnen beïnvloeden van regeneratieve succes^5,9 en vertegenwoordigen therapeutisch doelwit, maar deze processen zijn nog steeds niet duidelijk omschreven op moleculair niveau. Stijgingen van de trofische factor signalering of eliminatie van endogene remmen, zoals de Pten fosfatase¹⁰, kunnen resulteren in axonale regeneratie in bepaalde omstandigheden. Combinaties van verschillende methoden gevonden worden individueel effectieve verstrek ook alleen beperkte totale terugwinning tot op heden^11,12,13,14. Daarom is er een wanhopige behoefte om te identificeren van extra trajecten voor gerichte therapie. Naast de inleiding van axon hergroei, of en hoe axonen opnieuw aan de juiste doelgroep, hervorming synapse specificiteit, draad en bereiken functionele herstel zijn belangrijke onbeantwoorde vragen.

Kortom is de huidige begrip van de machine dicteert axon regeneratie nog zeer fragmentarisch. Deel van het probleem is de technische moeilijkheid van het bestuderen van axon regeneratie bij zoogdieren in real-time, een aanpak die is duur, tijdrovend en uitdagend voor het uitvoeren van grootschalige genetische schermen. Drosophila melanogaster, aan de andere kant, heeft bewezen een uitzonderlijk krachtig systeem voor de studie van complexe biologische vragen. De fruitvlieg behulpzaam bij het definiëren van genen en signalering van trajecten die zijn opvallend bewaard bij de mens geweest en is een succesvol model voor de studie van menselijke aandoeningen, zoals neurodegeneratieve aandoeningen, door de enorme moleculaire genetica-gereedschappen beschikbaar voor het manipuleren van gene functie¹⁵. In het bijzonder, fruitvliegjes worden beschouwd als een ideaal hulpmiddel voor de ontdekking van de genen die betrokken zijn in de neurale letsel en hergroei^15,16. Verschillende vliegen neurale letsel modellen zijn ontwikkeld, met inbegrip van volwassene-hoofd of larvale ventrale zenuw snoer (VNC) steken met naalden, larvale VNC of Verbrijzeling van de zenuw met pincet larvale neuron laser axotomy, olfactorische receptor neuron verwijdering, explantaten hersenletsel, en laesie van de perifere zenuw door vleugel severance^{15,17,18,19,20,21,22,23}. Opwindend, hebben recente werk met behulp van Drosophila letsel modellen geavanceerde ons begrip van de cellulaire en genetische trajecten die door het zenuwstelsel gebruikt om te reageren op neurale letsel, waarvan een aantal is aangetoond dat ze worden bewaard in zoogdieren^{24 ,25}. Nogmaals, dit benadrukt het nut van deze modelorganisme voor herkenbare roman mechanismen voor neurale reparatie.

Hier beschreven is een twee-foton laser gebaseerde Drosophila larvale sensorisch neuron letsel model. Een twee-foton laser werd voor het eerst gebruikt te snijden axonen in zebrafish in vivo in 2003²⁶. In datzelfde jaar werd de eerste laser dendriotomy uitgevoerd in Drosophila met behulp van een gepulseerde stikstof laser²⁷. Kort daarna, gebruikt verschillende C. elegans labs femtoseconde lasers om modellen van axon regeneratie²⁸. In 2007, Wu en collega’s vergeleken en de verschillen tussen laser verwondingen in C. elegans geïnduceerd door verschillende soorten lasers²⁹gemeld. In 2010 bleek axon regeneratie na laser axotomy eerste optreden in Drosophila³⁰. Voortbouwend op deze uitgebreide laser letsel literatuur, hebben we een model van de vlieg neurale letsel met behulp van de laser twee-foton, waarmee nauwkeurige inductie van letsel naar gerichte sites met minimale verstoring van de aangrenzende weefsels, bieden een relatief schone systeem om te studeren zowel de intrinsieke en extrinsieke eigenschappen van neuroregeneration met eencellige resolutie. In het bijzonder hebben we een aantal letsel methoden voor de sensorische neuronen dendritische arborization (da) opgericht in zowel het perifere zenuwstelsel (PNS) en CNS. Da neuronen kunnen worden ingedeeld in vier verschillende klassen onderscheiden zich vooral door hun dendriet vertakkende complexiteit: klasse I tot en met IV³¹. Onze gepubliceerde werk toont dat da neuron regeneratie lijkt op zoogdieren schade modellen op de fenotypische en moleculair niveau: da neuronen beeldschermeigenschappen klasse specifieke regeneratie, met klasse IV maar niet klasse I of III da neuronen exposeren regeneratie in de PNS; klasse IV da neuron axonen regenereren krachtig in de periferie, maar hun regeneratieve potentieel is drastisch verminderd in het VNV, dus lijkend op achterwortelganglia ganglion (DRG) neuronen in zoogdieren; verbetering van de mTOR activiteit via Pten verbetert schrapping of Akt overexpressie axon regeneratie in de vlieg CNS¹⁹. Gebruik makend van dit letsel model, wij hebben het uitvoeren van genetische schermen en hebben het RNA verwerking enzym Rtca geïdentificeerd als een evolutionair geconserveerde remmende factor voor axon regeneratie, koppelen van axon blessure tot cellulaire stress en RNA wijziging²⁰ .

In de gepresenteerde paradigma, wordt de schade veroorzaakt via laser axotomy/dendriotomy van larvale klasse IV of III da neuronen, gelabeld door ppk-CD4-tdGFP of 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80, respectievelijk. De schade wordt uitgevoerd op 2^nd aan 3^rd instar-larven op ongeveer 48-72 uur na ei leggen (h AEL). Voor PNS is axotomy de laesie gericht op de sectie van axon ~ 20-50 µm uit de buurt van de cel lichaam, voor CNS axotomy naar een gebied van ~ 20 µm in diameter bij het knooppunt commissuur de VNC en dendriotomy aan de primaire dendritische vertakkingspunten. Het dezelfde neuron is beeld 8-24 uur na letsel (AI) om te bevestigen de volledige transect, en bij 48-72 h AI te beoordelen van de regeneratie. Via time-lapse confocal imaging, kunnen de degeneratie en regeneratie van individuele axonen/dendrites die gewonde in vivo zijn na verloop van tijd worden gecontroleerd.

Protocol

1. bereiding van de platen van de cultuur en flessen Bereiding van druivensap agar platen Voeg 10 g agar poeder, 200 mL druiven SAP en 192 mL ddH2O in een bekerglas en magnetron voor ongeveer 4-5 min, roeren met tussenpozen totdat de agar volledig is opgelost. In een zuurkast afkoelen van de oplossing tot ca. 60 ° C. 4.2 mL 95% ethanol en 4,0 mL ijsazijn toevoegen. Het totale volume van de oplossing tot 400 mL met ddH2O. Mix goed aanpassen. Voeg ongeveer 2-3 …

Representative Results

Da neuronen Toon differentiële regeneratie potentiële tussen de perifere en centrale zenuwstelsel, evenals de specificiteit van de klasse. Dit biedt unieke kansen om te screenen op nieuwe factoren die vereist voor de regeneratie van de axon zijn (met behulp van de klasse IV PNS letsel), evenals die zijn remmende voor regeneratie (met klasse IV CNS letsel en klasse III PNS letsel). Axon regeneratie in de PNS <p class="jove_con…

Discussion

Wanneer opzetten vlieg kruist, kan het aantal vrouwtjes en mannetjes gebruikt variëren naargelang de genotypen en het aantal larven die nodig zijn voor specifieke experimenten. Voor WT vliegen, typische Kruis gebruikt 10 teefjes en 5 reutjes. Het venster van de collectie kan worden verkleind, afhankelijk van de nauwkeurigheid van de leeftijd van de larven vereist. Bijvoorbeeld, zal een periode van 2-h collectie larven van een meer homogene populatie opleveren. In dit geval zal met behulp van 20 of meer Maagd vrouwtjes i…

Materials

Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous	Acros Organics	AC615080010
Halocarbon 27 Oil	Genesee Scientific	59-133
Phosphate buffered saline (PBS), 20x Concentrate, pH 7.5, supplier # E703-1L	VWR	97062-948
Agar powder, Alfa Aesar, 500GM	VWR	AAA10752-36
Grape juice	Welch’s
Ethanol 95% (Reagent Alcohol 95%)	VWR	64-17-5
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
Propionic Acid	J.T.Baker	U33007
Cover Glasses: Rectangles	Fisher Scientific	12-544-D	50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 laser scanning microscope	Zeiss
Zen software	Zeiss
Chameleon Ultra II	Coherent