Un modèle de blessure de Drosophila In Vivo pour étudier la neurogenèse dans le périphérique et le système nerveux Central

Summary

Nous présentons ici un protocole utilisant la drosophile neurone sensitif – modèle de blessure de neurone arborisation dendritique (da), qui combine en vivo live imaging, deux photons laser axotomie/dendriotomy et la puissante mouche génétique boîte à outils, comme une plateforme de criblage éventuels promoteurs et inhibiteurs de la neurogenèse.

Abstract

La capacité de régénération des neurones endommagés régit la neurogenèse et la récupération fonctionnelle après un traumatisme du système nerveux. Dans les dernières décennies, diverses intrinsèques et extrinsèques inhibiteurs facteurs impliqués dans la restriction de la régénération axonale ont été identifiés. Toutefois, simplement supprimer ces signaux inhibiteurs est insuffisant pour une saine régénération, indiquant l’existence de mécanismes réglementaires supplémentaires. Drosophila melanogaster, la mouche à fruit, partage des gènes évolutivement conservés et voies de signalisation avec les vertébrés, y compris les humains. Alliant la puissante boîte à outils génétique des mouches à deux photons laser axotomie/dendriotomy, nous décrivons ici le neurone sensitif Drosophila – modèle de blessure neurone arborisation dendritique (da) comme une plate-forme pour le dépistage systématique pour roman régulateurs de régénération. Brièvement, ce paradigme inclut un) la préparation de larves, l’induction b) lésion à dendrite(s) ou en utilisant un laser deux photons, c) direct confocal imagerie après lésion d) analyse de données et d’axon(s). Notre modèle permet une blessure très reproductible de neurones marqués, les axones et les dendrites des sous-types neuronales bien définis, dans les périphériques et le système nerveux central.

Introduction

L’incapacité des axones à se régénérer après une lésion du système nerveux central (CNS), peut conduire à une invalidité permanente chez les patients et joue également un rôle dans les déficits neurologiques irréversibles dans des maladies neurodégénératives^{1,2 ,3,4,5}. L’environnement de la CNS, ainsi que la capacité de croissance intrinsèque des neurones, détermine si les axones sont capables de régénérer après un traumatisme. Les facteurs extracellulaires des oligodendrocytes, astroglials et fibroblastiques sources auraient dû être divulgués d’entraver la croissance neuronale^4,6,7,8, mais l’élimination de ces molécules ne permet que de limited⁵la germination. Intrinsèque de la régénération de signaux peuvent influencer le succès régénératrice^5,9 et représentent des cibles thérapeutiques potentielles, mais ces processus ne sont toujours pas bien définis au niveau moléculaire. Augmentations de facteur trophique de signalisation ou d’élimination des freins endogènes, tels que le gène Pten phosphatase¹⁰, peuvent entraîner la régénération axonale dans certaines circonstances. Combinaisons de différentes méthodes individuellement efficaces fournissent également seulement restauration globale limitée à ce jour^11,12,13,14. Par conséquent, il y a un besoin désespéré d’identifier des voies supplémentaires pour thérapie ciblée. En plus de l’ouverture de la repousse axonale, si et comment les axones recâbler à la bonne cible, la spécificité de la réforme de synapse et atteindre la récupération fonctionnelle d’importantes questions sans réponse.

En résumé, notre compréhension actuelle de la machinerie dictant la régénération axonale est encore très fragmentaire. Une partie du problème est la difficulté technique de l’étude axon régénération chez les mammifères en temps réel, une approche qui est coûteux, chronophages et stimulant pour la réalisation des écrans génétiques à grande échelle. Drosophila melanogaster, en revanche, s’est avéré pour être un système extrêmement puissant pour l’étude des questions biologiques complexes. La drosophile a joué un rôle important dans la définition des gènes et de signalisation des voies qui sont remarquablement conservées chez les humains et a été un modèle pour l’étude des conditions humaines, telles que les maladies neurodégénératives, grâce aux outils de la génétique moléculaire vaste disponibles pour manipuler les gènes fonction¹⁵. En particulier, les mouches des fruits sont considérés comme un outil idéal pour la découverte de gènes impliqués dans la lésion neurale et repousse le^15,16. Plusieurs modèles de mouche lésion neuronale ont été développés, y compris la tête adulte ou larvaire nerveuse ventrale cordon (VNC) poignardant avec aiguilles, VNC larvaire ou écrasement du nerf avec forceps, neurone larvaire laser axotomie, enlèvement des neurones récepteurs olfactifs, explants de traumatisme crânien, et lésion des nerfs périphériques par aile départ^{15,17,18,19,20,21,22,23}. Passionnante, récent travail utilisant modèles de lésion de drosophile ont fait progresser notre compréhension des voies cellulaires et génétiques utilisées par le système nerveux pour répondre aux blessures neurales, dont certains auraient dû être divulgués à conserver chez les mammifères^{24 ,},²⁵. Encore une fois, cela fait ressortir l’utilité de cet organisme modèle pour identifier de nouveaux mécanismes de réparation neuronale.

Décrit ici est un modèle de blessure du Drosophila biphotonique par laser larvaire neurone sensitif. Un laser à deux photons a été utilisé pour couper des axones dans le poisson-zèbre en vivo en 2003²⁶. La même année, le premier dendriotomy de laser a été réalisée chez la drosophile à l’aide d’un de laser pulsé azote²⁷. Lasers femtosecondes a été utilisé pour établir des modèles de régénération axonale²⁸peu après, plusieurs laboratoires de c. elegans . En 2007, Wu et ses collègues comparativement et signalé les différences entre les blessures de laser chez c. elegans induite par différents types de lasers à²⁹. En 2010, la régénération axonale après laser axotomie fut montrée chez Drosophila³⁰. S’appuyant sur cette littérature de blessure laser vaste, nous avons développé un modèle de mouche blessures neurales à l’aide de deux photons laser, ce qui permet à induction précise des lésions aux sites ciblés avec une perturbation minimale des tissus voisins, fournissant un endroit relativement propre système pour étudier les propriétés intrinsèques et extrinsèques de neurodégénérescence avec résolution de cellule unique. Plus précisément, nous avons établi un ensemble de méthodes de blessures pour les neurones sensoriels de l’arborisation dendritique (da) dans les deux système nerveux périphérique (PNS) et CNS. Neurones dopaminergiques peuvent être regroupés en quatre classes distinctes se distingués principalement par leur complexité de ramification de dendrite : classe I à IV,³¹. Nos travaux publié montrent que la régénération des neurones da ressemble à modèles de lésion chez les mammifères au niveau phénotypique et moléculaire : neurones dopaminergiques afficher des propriétés de régénération spécifiques de classe, avec la classe IV, mais pas de classe I ou les neurones da III présentant la régénération dans le PNS ; axones de neurones classe IV da régénèrent robuste dans la périphérie, mais leur potentiel de régénération est considérablement réduite dans le SNC, ressemblant ainsi à des neurones ganglionnaires (DRG) racine dorsale chez les mammifères ; activité de mTOR via Pten suppression ou Akt surexpression améliore la régénération axonale dans la volée CNS¹⁹. En utilisant ce modèle de blessures, nous ont de bons écrans génétiques et ont identifié l’enzyme de traitement RNA Rtca comme un facteur inhibiteur évolutivement conservé pour la régénération axonale, reliant des lésions axonales au stress cellulaire et modification de RNA²⁰ .

Dans le modèle présenté, la blessure est induite par laser axotomie/dendriotomy des larve classe IV ou les neurones da III, étiquetés par ppk-CD4-tdGFP ou 19-12-Gal4, SAMU-CD4-tdGFP, repo-Gal80, respectivement. La blessure s’effectue sur 2^nd à 3^rd stade larvaire à environ 48 à 72 heures après la ponte (h AEL). Pour PNS axotomie la lésion est visée à la section de l’axone ~ 20-50 µm loin du corps de la cellule, pour axotomie CNS d’une superficie d’environ 20 µm de diamètre à la jonction de la commissure dans VNC et dendriotomy aux points direction dendritiques primaires. Même neurone est imagé à 8 à 24 heures après la lésion (AI) pour confirmer la transection complète et à 48-72 h AI pour évaluer la régénération. Par le biais de l’imagerie confocale Time-lapse, la dégénérescence et la régénération des axones/dendrites individuels qui ont été blessés en vivo peuvent être surveillés au fil du temps.

Protocol

1. préparation des plaques de Culture et bouteilles Préparation des boîtes de gélose de jus de raisin Ajouter 10 g de poudre d’agar, jus de raisin 200 mL et mL 192 ddH2O dans un bécher et four à micro-ondes pendant environ 4-5 min, en remuant par intermittence jusqu’à dissolution complète de la gélose. Sous une hotte, refroidir la solution à environ 60 ° C. Ajouter 4,2 mL d’éthanol à 95 % et 4,0 mL d’acide acétique glacial. Réglez le volume total de la solution…

Representative Results

Neurones dopaminergiques montrent régénération différentielle potentiels entre le périphérique et du système nerveux central, ainsi que la spécificité de la classe. Ceci fournit une occasion unique de dépister les nouveaux facteurs qui sont requises pour la régénération axonale (à l’aide de la classe des blessures IV PNS), ainsi que celles qui sont inhibitrices de la régénération (avec la blessure de classe IV CNS et classe blessure III PNS). <p class="jove_step" fo…

Discussion

Quand traverse le paramétrage de la mouche, le nombre de femelles et mâles utilisés peut varier selon les génotypes et le nombre de larves nécessaires pour les expériences spécifiques. Pour les mouches WT, Croix typique utilise 10 femelles et 5 mâles. La fenêtre de la collection peut être réduite, selon la précision de l’âge des larves. Par exemple, une période de 2 h collection donneront des larves d’une population plus homogène. Dans ce cas, à l’aide de femelles de 20 ou plus vierges à mettre en …

Materials

Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous	Acros Organics	AC615080010
Halocarbon 27 Oil	Genesee Scientific	59-133
Phosphate buffered saline (PBS), 20x Concentrate, pH 7.5, supplier # E703-1L	VWR	97062-948
Agar powder, Alfa Aesar, 500GM	VWR	AAA10752-36
Grape juice	Welch’s
Ethanol 95% (Reagent Alcohol 95%)	VWR	64-17-5
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
Propionic Acid	J.T.Baker	U33007
Cover Glasses: Rectangles	Fisher Scientific	12-544-D	50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 laser scanning microscope	Zeiss
Zen software	Zeiss
Chameleon Ultra II	Coherent