Molekulare Analyse der endothelialen Mesenchymale Transition induziert durch Transforming Growth Factor-β-Signalisierung
Summary
Ein Protokoll für in-vitro- Induktion von endothelial-Mesenchymale Transition (EndMT), die nützlich für die Untersuchung von zelluläre Signalwege an EndMT beteiligt ist, wird beschrieben. In diesem experimentellen Modell ist EndMT durch Behandlung mit TGF-β in MS-1 Endothelzellen induziert.
Abstract
Phänotypische Plastizität der Endothelzellen zugrunde liegt, Herz-Kreislauf-System-Entwicklung, Herz-Kreislauf-Krankheiten und verschiedenen Bedingungen im Zusammenhang mit Orgel Fibrose. Unter diesen Bedingungen erwerben differenzierte endotheliale Zellen mesenchymalen-ähnlichen Phänotypen. Diesen Prozess nennt man endothelial-Mesenchymale Transition (EndMT) und zeichnet sich durch Herabregulation der endotheliale Marker, Hochregulation von mesenchymalen Marker und morphologische Veränderungen. EndMT wird durch mehrere Signalwege, einschließlich der Umwandlung Wachstumsfaktor (TGF) induziert-β, Wnt und Kerbe, und reguliert durch die molekularen Mechanismen, die für die Gastrulation, Gewebe Fibrose, ähnlich denen der epitheliale-Mesenchymale Transition (EMT) wichtig und Krebsmetastasen. Verständnis der Mechanismen des EndMT ist wichtig, diagnostische und therapeutische Ansätze für EndMT zu entwickeln. Robuste Induktion der EndMT in Vitro ist nützlich, um gemeinsame Gen Ausdruck Signaturen zu charakterisieren, druggable Molekulare Mechanismen zu identifizieren und Bildschirm für Modulatoren des EndMT. Hier beschreiben wir eine in-vitro- Methode zur Induktion von EndMT. MS-1 Maus Pankreas mikrovaskuläre Endothelzellen unterliegen EndMT nach längerer Einwirkung von TGF-β und Hochregulation der mesenchymalen Marker und morphologische Veränderungen aber auch Induktion von mehreren entzündlichen Chemokinen und Zytokinen. Methoden für die Analyse von MicroRNA (MiRNA) Modulation sind ebenfalls enthalten. Diese Methoden bieten eine Plattform, um die Mechanismen, die EndMT und der Beitrag der MiRNAs, EndMT zu untersuchen.
Introduction
Endothelial-Mesenchymale Transition (EndMT) ist der Prozess, durch den ein differenzierter Endothelzellen eine Vielzahl von molekularen Veränderungen in einer Fibroblasten-ähnliche Mesenchymale Zellen1erfährt. EndMT wurde ursprünglich als eine Transformation der Endothelzellen während der Entwicklung des Herzens2,3beschrieben. In einem frühen Entwicklungsstadium der Herzen besteht das Herz Rohr aus einer inneren Endokards und einer äußeren Myokard. Diese beiden Schichten sind durch eine Schicht der extrazellulären Matrix genannt das kardiale Gelee getrennt. Die embryonalen endokardialen Zellen, die Endothelzellen Marker erwerben, transit in Mesenchymale Zellen, dringen in das zugrunde liegende kardiale Gelee, und Bildung von kardialen Kissen, bietet die Grundlage für die ventrikulären Ventile und septum und die Semilunar Ventile. Darüber hinaus wurde EndMT vermutet, zu Quellen von perizyten und vaskulären glatten Muskelzellen in anderen embryonalen Gefäßsysteme einschließlich der Herzkranzgefäße, abdominale Aorta und Lungenarterie4,5,6. Darüber hinaus ist EndMT in physiologischen angiogenen sprießen7verwickelt.
Sammeln Beweise hat vorgeschlagen, dass EndMT auch mehrere Herz-Kreislauf-Krankheiten und anderen Krankheiten1,8beteiligt ist. EndMT verbundenen Bedingungen sind Gefäßverkalkung, Arteriosklerose, pulmonaler arterieller Hypertonie, höhlenartigen Fehlbildung, Orgel Fibrose, Vene Transplantat Umbau, Allograft Dysfunktion im Nieren-Transplantation und Krebs8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18. ein kürzlich veröffentlichter Bericht beschrieben, dass mehrere molekulare Marker der EndMT ein Werkzeug für die Diagnose und Prognose Vorhersage der renal Transplantation Dysfunktion bei Nieren-Transplantation17sein können. Modulation des EndMT bedingte zelluläre Signalwege haben gezeigt, dass mehrere Erkrankungen einschließlich kardialer Fibrose zu verbessern und Vene Transplantat Umbau in Tier8,15Modelle. Daher ist das Verständnis der Mechanismen zugrunde liegenden EndMT wichtig, diagnostische und therapeutische Strategien für EndMT zu entwickeln.
EndMT zeichnet sich durch Verlust der Zell-Zell-Verbindungen, Erhöhung der wandernden Potenzial, Herabregulation der endothelialen-spezifischen Gene wie VE-Cadherin und Hochregulation der mesenchymalen Gene unter anderem α-Glattmuskel Aktin (α-SMA). Darüber hinaus sind EndMT und epitheliale-Mesenchymale Transition (EMT), ein ähnlicher Prozess, die Epithelzellen in Mesenchymale Zellen konvertiert mit veränderten Produktion verschiedener Komponenten der extrazellulären Matrix, die zur Entwicklung beitragen können von Gewebe Fibrose8,19.
Vor kurzem haben mehrere in-vitro- Studien von EndMT Details der molekularen Mechanismen von EndMT15,20aufgeklärt. EndMT wird durch verschiedene Signalwege, einschließlich der Umwandlung Wachstumsfaktor (TGF) induziert-β, Wnt, und1Kerbe. Unter ihnen spielt TGF-β entscheidende Rolle in der Induktion von EMT und EndMT. In EndMT verlängert Exposition gegenüber TGF-β Ergebnisse in EndMT in verschiedenen Endothelzellen, während kurze Belichtungszeiten scheint unzureichend21zu sein. Wir beschrieben hier eine einfache Protokoll für EndMT Induktion, wobei Meile SVEN 1 (MS-1) Maus Pankreas mikrovaskuläre Endothelzellen EndMT in Vitro nach längerer Einwirkung von TGF-β20unterziehen. In diesem Modell können mehreren nachgeschaltete Analysen durchgeführt werden, um die typischen Merkmale des EndMT, einschließlich morphologische Veränderungen, Downregulation endotheliale Marker, Hochregulation der mesenchymalen Marker und entzündlichen Gene, Zellskelett untersuchen Umstellungen und Kollagen gel Kontraktion.
Micro-RNAs (MiRNAs) sind ~ 22 nt kleine regulatorische RNAs, die direkte posttranskritionelle Unterdrückung der verschiedenen mRNA Ziele22,23. Durch Samen, Sequenz-vermittelten Zielerfassung MiRNAs Hunderte von Zielgenen zu unterdrücken und zu modulieren, diverse Zellfunktionen wie Zell-Differenzierung, Proliferation und Motilität. Dies gilt auch für die Verordnung von EMT und EndMT, und verschiedene MiRNAs als Regulatoren der EMT und EndMT24,25gemeldet wurden. In diesem Beitrag vorgestellte EndMT-Modell ist mit MiRNA Modulation Verfahren testen Sie die Rollen von MiRNAs in EndMT kombinierbar. Im Rahmen dieser Untersuchung fasst unsere experimentellen Verfahren zur Untersuchung von TGF-β-induzierte EndMT in MS-1-Zellen und umfasst auch Vergleich der Bedingungen der EndMT Induktion von TGF-β in anderen Endothelzellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es wurde berichtet, dass aktivierte Ras und TGF-β Behandlung für 24 h EndMT in MS-1-Zellen, induzierten während TGF-β allein nicht EndMT in diesem kurzen Zeitraum21zu induzieren. Konsequent haben wir beobachtet, dass TGF-β wesentlich EndMT nach längerer Behandlung (48-72 h) in MS-1 Zellen20induziert. EndMT wurde wiederholt beobachtet, nachdem längere Behandlung mit TGF-β (2 – 6 Tage) in verschiedenen Endothelzellen wie menschlichen Nabelschnur Vene Endothelzellen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Zea Borok und Kohei Miyazono für Anregungen bei der Vorbereitung des Manuskripts. H.I.S und m.h. werden unterstützt durch Uehara Memorial Foundation Research Fellowship und H.I.S stützt sich auf die Osamu Hayaishi Memorial Scholarship für Study Abroad. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von Takeda Science Foundation (A.S.) unterstützt.
Materials
| MS-1 cells | American Type Culture Collection | CRL-2279 | |
| MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 32571036 | |
| TGF-beta2 | R&D | 302-B2-002 | |
| 4 well Lab-Tek II Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 | |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Blocking One | nacalai tesque | 03953-95 | |
| phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| TOTO-3 iodide | Thermo Fisher Scientific | T3604 | |
| VE cadherin monoclonal antibody (BV13) | Thermo Fisher Scientific | 14-1441-82 | |
| alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4) | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Cover slip | Thermo Fisher Scientific | 174934 | |
| Collagen solution | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
| Collagen dilution buffer | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
| LNA miRNA inhibitor | EXIQON | miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA) | |
| synthetic miRNA duplex | Qiagen | miScript miRNA Mimic | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778030 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
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