JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Mezenkimal endotel geçiş büyüme faktörü β sinyal dönüşüm tarafından indüklenen moleküler Analizi

Published: August 03, 2018
doi:
10.3791/57577
, , ,
1David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research,Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Respiratory Medicine, Graduate School of Medicine,The University of Tokyo, 3Hastings Center for Pulmonary Research, Division of Pulmonary, Critical Care and Sleep Medicine, Department of Medicine, Keck School of Medicine,University of Southern California, 4Department of Molecular Pathology, Graduate School of Medicine,The University of Tokyo

Summary

Hücresel sinyal yolları içinde EndMT ilgili soruşturma için yararlı olan endotel mezenkimal geçiş (EndMT), vitro indüksiyon için bir protokol açıklanmıştır. Bu deneysel modelinde, TGF-β MS-1 endotel hücreleri ile tedavi tarafından EndMT indüklenen.

Abstract

Endotel hücrelerinin fenotipik plastisite kardiyovasküler sistem geliştirme, kalp-damar hastalıkları ve organ fibrozis ile ilişkili çeşitli koşullar altında yatan. Bu koşullar içinde farklılaştırılmış endotel hücreleri gibi mezenkimal fenotipleri elde etmek. Bu işlem mezenkimal endotel geçiş (EndMT) adı verilir ve downregülasyon endotel işaretleri, upregulation mezenkimal işaretleri ve morfolojik değişiklikler ile karakterizedir. EndMT dönüştürme büyüme faktörü (TGF) de dahil olmak üzere birkaç sinyal yolları tarafından indüklenen-β, Wnt ve çentik ve gastrulasyon, doku fibrozu, epitelyal ve mezenkimal geçiş (EMT) önemli benzer moleküler mekanizmaları tarafından düzenlenir ve kanser metastaz. EndMT mekanizmaları anlama EndMT hedefleme tanı ve tedavi edici yaklaşımlar geliştirmek önemlidir. EndMT vitro sağlam indüksiyon ortak gen ifade imzalar karakterize druggable moleküler mekanizmaları tanımlayıp EndMT modülatörler için ekran yararlıdır. Burada, EndMT indüksiyon için bir vitro yöntemi açıklanmaktadır. MS-1 fare pankreas mikrovasküler endotel hücreler TGF-β uzun süre maruz kaldıktan sonra EndMT geçmesi ve upregulation mezenkimal işaretleri ve morfolojik değişiklikler yanı sıra birden fazla inflamatuar kemokinler ve sitokinler indüksiyon gösterir. MikroRNA (miRNA) modülasyon analizi için yöntemler de yer almaktadır. Bu yöntemleri EndMT ve miRNAs EndMT için katkısını temel mekanizmaları araştırmak için bir platform sağlar.

Introduction

Mezenkimal endotel geçiş (EndMT) tarafından fibroblast benzeri mezenkimal hücre1‘ kaynaklanan moleküler değişiklikler çeşitli farklı endotel hücre uğrar işlemidir. EndMT başlangıçta bir endotel hücre dönüştürme sırasında kalp2,3gelişimi olarak nitelendirildi. Erken kalp geliştirme, bir iç endokard ve bir dış Miyokardiyum kalbini tüp oluşur. Bu iki kat hücre dışı matriks kardiyak jöle adı verilen bir tabaka tarafından ayrılır. Endotel hücre işaretleri elde, embriyonik endocardial hücreleri mezenkimal hücrelerin içine transit, altta yatan kalp jöle istila ve kardiyak minderler, atriyoventriküler kapaklar ve septum için temel sağlayan oluşumu teşvik ve Semilunar kapaklar. Ayrıca, EndMT kaynaklar perisitlerden ve vasküler düz kas hücreleri embriyonik diğer damar sistemleri Koroner damarları, abdominal aort ve pulmoner arter4,5,6dahil olarak öne sürülmüştür. Buna ek olarak, EndMT fizyolojik anjiogenik7çimlenme karıştığı.

Kanıt biriken EndMT birden fazla kalp-damar hastalıkları ve diğer hastalıklar1,8‘ de ilgilenmektedir önerdi. EndMT ilişkili koşullar vasküler kalsifikasyon, ateroskleroz, pulmoner arteriyel hipertansiyon, derin malformasyon, organ fibrozis, ven greft remodeling, homogreft disfonksiyon böbrek nakli ve kanser8‘yer, 9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18. son raporunda açıklanan birkaç moleküler EndMT işaretleri böbrek nakli17böbrek nakli işlev bozukluğu tanısı ve prognoz tahmini için bir araç olabilir. Kardiyak fibrozis de dahil olmak üzere birçok hastalığı koşulları iyileştirmek için modülasyon EndMT ilgili hücresel sinyal yollar gösterilmiştir ve damar grefti hayvan remodeling modelleri8,15. Bu nedenle, mekanizmaları anlama temel EndMT EndMT hedefleme tanı ve tedavi stratejileri geliştirmek önemlidir.

EndMT hücre-hücre kavşaklar, göçmen potansiyel artış, VE-cadherin gibi özel endotel genlerin downregülasyon ve α-düz kas aktin (α-SMA) dahil olmak üzere mezenkimal genlerin upregulation kaybı ile karakterizedir. Ayrıca, EndMT ve mezenkimal epitel geçiş (EMT), epitel hücreleri dönüştürür mezenkimal hücreler için benzer bir süreç gelişmesine katkıda bulunabilir çeşitli hücre dışı matriks bileşenlerinin değişmiş üretim ile ilişkili olan doku fibrozu8,19.

Son zamanlarda, EndMT birkaç vitro çalışmalar EndMT15,20moleküler mekanizmaları ayrıntılarını aydınlatılmamıştır. EndMT dönüştürme büyüme faktörü (TGF) de dahil olmak üzere çeşitli sinyal yolları tarafından indüklenen-β, Wnt ve çentik1. Bunlar arasında TGF-β EMT ve EndMT indüksiyon çok önemli rol oynar. Kısa maruz kalma yetersiz21gibi görünüyor iken EndMT içinde EndMT çeşitli endotel hücrelerinde sonuçlarında TGF-β maruz uzun. Biz burada EndMT indüksiyon, hangi mil SVEN 1 (MS-1) fare pankreas mikrovasküler endotel hücreleri TGF-β20uzun süreli maruz kaldıktan sonra EndMT vitro geçmesi için basit bir protokol nitelendirdi. Bu modelde, EndMT morfolojik değişiklikler, downregülasyon endotel işaretleri, upregulation mezenkimal işaretleri ve inflamatuar genler, hücre iskeleti de dahil olmak üzere, hallmark özelliklerini araştırmak için birden çok aşağı akım analizleri yapılabilir düzenlemeler ve kollajen jel kasılma.

MikroRNA (miRNAs) ~ 22 olan nt çeşitli mRNA hedefleri22,23posttranscriptional baskı doğrudan küçük düzenlemesinde. Tohum Serisi-aracılı hedef tanıma, miRNAs hedef genlerin yüzlerce bastırmak ve hücre farklılaşması, yayılması ve motilite gibi çeşitli hücresel fonksiyonları modüle. Bu da EMT ve EndMT düzenlemesine yönelik olgusu ve birkaç miRNAs EMT ve EndMT24,25düzenleyiciler bildirilmiştir. Bu derlemede sunulan EndMT modeli kolayca miRNAs rolleri EndMT içinde test etmek için miRNA modülasyon yordamlar ile kombine edilebilir. Mevcut İnceleme TGF-β-indüklenen EndMT MS-1 hücrelerdeki araştırmak için deneysel prosedürlerimiz özetler ve karşılaştırma EndMT indüksiyon TGF-β tarafından koşullarının diğer endotel hücrelerinde de içerir.

Protocol

1. indüksiyon EndMT MS-1 Standart kültür koşulları hücrelerde korumak ve confluency kaçının. MS-1 hücre bir kaynak Tablo reçetesiaçıklanmıştır. MS-1 hücreler için en az gerekli orta-α (MEM-α) % 10 fetal buzağı serum (FCS), 50 U/mL penisilin ve 50 μg/mL streptomisin ile kullanın. 10 cm hücrelerdeyse yıkama MS-1 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) x ile bulaşık ve tripsin 1.0 mL plaka ekleyin. 37 ° C’de 5 min için kuluçkaya Kültür ortamının 9 mL kull…

Representative Results

TGF-β çeşitli endotel hücrelerinde EndMT güçlü bir uyarıcı olduğunu. TGF-β MS-1 hücrelerdeki ile 24 h tedaviden sonra F-aktin için boyama aktin stres lifleri (Şekil 1A)20düzenlenmesi gösterir. Önarıtma ROCK inhibitörü Y-27632 ile aktin yeniden yapılanma20indüksiyon engeller. MS-1 endotel hücreleri mezenkimal seklinde morfoloji TGF-β tedavi (Şekil 1B) üzerin…

Discussion

TGF-β yalnız EndMT bu kısa dönem21‘ ikna etmek başarısız iken 24 h için etkin Ras ve TGF-β tedavi EndMT MS-1 hücrelerdeki indüklenen bildirilmiştir. Sürekli olarak, TGF-β önemli ölçüde EndMT sonra uzun tedavi (48-72 h) MS-1 hücreleri20dakika sonra indüklenen görülmektedir. Sonra uzun süreli tedavi ile TGF-β (2-6 gün) insan göbek gibi çeşitli endotel hücrelerinde damar endotel hücreleri (HUVEC), insan kutanöz mikrovasküler endotel hücreleri (…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz Zea Borok ve Kohei Miyazono el yazması hazırlanmasında öneriler için teşekkür ederiz. H.I.S. ve M.H. Uehara Memorial Vakfı Araştırma Bursu tarafından desteklenir ve HIS Osamu Hayaishi Memorial bursu tarafından yurtdışında eğitim için desteklenir. Bu eser bir hibe Takeda Bilim Vakfı (A.S.) tarafından desteklenmiştir.

Materials

MS-1 cells American Type Culture Collection CRL-2279
MEM-alpha Thermo Fisher Scientific 32571036
TGF-beta2 R&D 302-B2-002
4 well Lab-Tek II Chamber Slide Thermo Fisher Scientific 154526
Y-27632  Sigma-Aldrich Y0503
Blocking One nacalai tesque 03953-95
phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma-Aldrich P1951
TOTO-3 iodide Thermo Fisher Scientific T3604
VE cadherin monoclonal antibody (BV13) Thermo Fisher Scientific 14-1441-82
alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4) Sigma-Aldrich C6198
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A-11001
Cover slip Thermo Fisher Scientific 174934
Collagen solution Nitta gelatin Inc. Cellmatrix I-P
Collagen dilution buffer Nitta gelatin Inc. Cellmatrix I-P
LNA miRNA inhibitor EXIQON  miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA)
synthetic miRNA duplex Qiagen  miScript miRNA Mimic
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778030
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668027
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sanchez-Duffhues, G., Garcia de Vinuesa, A., Ten Dijke, P. Endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases: Developmental signaling pathways gone awry. Developmental Dynamics. , (2017).
  2. Markwald, R. R., Fitzharris, T. P., Smith, W. N. Structural analysis of endocardial cytodifferentiation. Developmental Biology. 42 (1), 160-180 (1975).
  3. Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis. Circulation Research. 77 (1), 1-6 (1995).
  4. Chen, Q., et al. Endothelial cells are progenitors of cardiac pericytes and vascular smooth muscle cells. Nature Communications. 7, 12422 (2016).
  5. DeRuiter, M. C., et al. Embryonic endothelial cells transdifferentiate into mesenchymal cells expressing smooth muscle actins in vivo and in vitro. Circulation Research. 80 (4), 444-451 (1997).
  6. Arciniegas, E., Neves, C. Y., Carrillo, L. M., Zambrano, E. A., Ramirez, R. Endothelial-mesenchymal transition occurs during embryonic pulmonary artery development. Endothelium. 12 (4), 193-200 (2005).
  7. Welch-Reardon, K. M., Wu, N., Hughes, C. C. A role for partial endothelial-mesenchymal transitions in angiogenesis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (2), 303-308 (2015).
  8. Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
  9. Chen, P. Y., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition drives atherosclerosis progression. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4514-4528 (2015).
  10. Bostrom, K. I., Yao, J., Guihard, P. J., Blazquez-Medela, A. M., Yao, Y. Endothelial-mesenchymal transition in atherosclerotic lesion calcification. Atherosclerosis. , 124-127 (2016).
  11. Qiao, L., et al. Endothelial fate mapping in mice with pulmonary hypertension. Circulation. 129 (6), 692-703 (2014).
  12. Ranchoux, B., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition in pulmonary hypertension. Circulation. 131 (11), 1006-1018 (2015).
  13. Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
  14. Krenning, G., Zeisberg, E. M., Kalluri, R. The origin of fibroblasts and mechanism of cardiac fibrosis. Journal of Cell Physiology. 225 (3), 631-637 (2010).
  15. Cooley, B. C., et al. TGF-beta signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling. Science Translational Medicine. 6 (227), 227ra234 (2014).
  16. Wang, Z., et al. Transforming Growth Factor-beta1 Induces Endothelial-to-Mesenchymal Transition via Akt Signaling Pathway in Renal Transplant Recipients with Chronic Allograft Dysfunction. Annals of Transplantation. 21, 775-783 (2016).
  17. Xu-Dubois, Y. C., et al. Markers of Endothelial-to-Mesenchymal Transition: Evidence for Antibody-Endothelium Interaction during Antibody-Mediated Rejection in Kidney Recipients. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (1), 324-332 (2016).
  18. Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts. Cancer Research. 67 (21), 10123-10128 (2007).
  19. Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., Gomez-Puerto, M. C., Ten Dijke, P. TGF-beta-Induced Endothelial-Mesenchymal Transition in Fibrotic Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).
  20. Mihira, H., et al. TGF-beta-induced mesenchymal transition of MS-1 endothelial cells requires Smad-dependent cooperative activation of Rho signals and MRTF-A. Journal of Biochemistry. 151 (2), 145-156 (2012).
  21. Hashimoto, N., et al. Endothelial-mesenchymal transition in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 43 (2), 161-172 (2010).
  22. Suzuki, H. I., Miyazono, K. Dynamics of microRNA biogenesis: crosstalk between p53 network and microRNA processing pathway. Journal of Molecular Medicine (Berl). 88 (11), 1085-1094 (2010).
  23. Suzuki, H. I., Miyazono, K. Emerging complexity of microRNA generation cascades. Journal of Biochemistry. 149 (1), 15-25 (2011).
  24. Nicoloso, M. S., Spizzo, R., Shimizu, M., Rossi, S., Calin, G. A. MicroRNAs–the micro steering wheel of tumour metastases. Nature Reviews Cancer. 9 (4), 293-302 (2009).
  25. Lagendijk, A. K., Goumans, M. J., Burkhard, S. B., Bakkers, J. MicroRNA-23 restricts cardiac valve formation by inhibiting Has2 and extracellular hyaluronic acid production. Circulation Research. 109 (6), 649-657 (2011).
  26. Katsura, A., et al. MicroRNA-31 is a positive modulator of endothelial-mesenchymal transition and associated secretory phenotype induced by TGF-beta. Genes Cells. 21 (1), 99-116 (2016).
  27. Suzuki, H. I., et al. Regulation of TGF-beta-mediated endothelial-mesenchymal transition by microRNA-27. Journal of Biochemistry. 161 (5), 417-420 (2017).
  28. Camenisch, T. D., et al. Temporal and distinct TGFbeta ligand requirements during mouse and avian endocardial cushion morphogenesis. Developmental Biology. 248 (1), 170-181 (2002).
  29. Krenning, G., Moonen, J. R., van Luyn, M. J., Harmsen, M. C. Vascular smooth muscle cells for use in vascular tissue engineering obtained by endothelial-to-mesenchymal transdifferentiation (EnMT) on collagen matrices. Biomaterials. 29 (27), 3703-3711 (2008).
  30. Medici, D., Potenta, S., Kalluri, R. Transforming growth factor-beta2 promotes Snail-mediated endothelial-mesenchymal transition through convergence of Smad-dependent and Smad-independent signalling. Biochemical Journal. 437 (3), 515-520 (2011).
  31. Krizbai, I. A., et al. Endothelial-mesenchymal transition of brain endothelial cells: possible role during metastatic extravasation. PLoS One. 10 (3), e0119655 (2015).
  32. Arciniegas, E., Sutton, A. B., Allen, T. D., Schor, A. M. Transforming growth factor beta 1 promotes the differentiation of endothelial cells into smooth muscle-like cells in vitro. Journal of Cell Science. 103 (Pt 2), 521-529 (1992).
  33. Deissler, H., Deissler, H., Lang, G. K., Lang, G. E. TGFbeta induces transdifferentiation of iBREC to alphaSMA-expressing cells. International Journal of Molecular Medicine. 18 (4), 577-582 (2006).
  34. Paranya, G., et al. Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro. American Journal of Pathology. 159 (4), 1335-1343 (2001).
  35. Maleszewska, M., et al. IL-1beta and TGFbeta2 synergistically induce endothelial to mesenchymal transition in an NFkappaB-dependent manner. Immunobiology. 218 (4), 443-454 (2013).
  36. Ubil, E., et al. Mesenchymal-endothelial transition contributes to cardiac neovascularization. Nature. 514 (7524), 585-590 (2014).
  37. Xu, X., et al. Epigenetic balance of aberrant Rasal1 promoter methylation and hydroxymethylation regulates cardiac fibrosis. Cardiovasc Research. 105 (3), 279-291 (2015).
  38. Xiao, L., et al. Tumor Endothelial Cells with Distinct Patterns of TGFbeta-Driven Endothelial-to-Mesenchymal Transition. Cancer Research. 75 (7), 1244-1254 (2015).

Tags

Endothelial-mesenchymal TransitionTGF-β SignalingMolecular AnalysisVascular BiologyCancer BiologyEndothelial PlasticityIn Vitro EndMTMS-1 Endothelial CellsCell CultureTrypsinizationCell CountingTGF-β2 StimulationROCK InhibitorImmunofluorescence StainingPhallotoxinNuclear Staining
check_url/57577?article_type=t&slug=molecular-analysis-endothelial-mesenchymal-transition-induced

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Suzuki, H. I., Horie, M., Mihira, H., Saito, A. Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-β Signaling. J. Vis. Exp. (138), e57577, doi:10.3791/57577 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image