GPC3 ターゲット バイスペシフィック抗体、GPC3 S Fab 強力な細胞毒性を持つ
Summary
紹介でバイスペシフィック抗体 GPC3 S Fab プロトコル大腸菌。精製 GPC3 S Fab GPC3 陽性肝癌細胞に対して強力な細胞毒性があります。
Abstract
このプロトコルでは、建設、バイスペシフィック抗体 (bsAb) GPC3 S 工場の機能性研究をについて説明します。bsAbs は彼らの 2 つの異なる腕を介して 2 つの異なるエピトープを認識できます。bsAbs を積極的に直接腫瘍細胞を殺すために免疫細胞を募集する能力について研究されています。現在、bsAbs の大半は Fc 含む bsAbs または Fc 領域なし小さい bsAb デリバティブとして組換え蛋白の形で生産されています。本研究では GPC3-S-ファブ、抗体フラグメント (Fab) に基づいてバイスペシフィック抗体は抗 gpc3 由来抗体 GC33 抗 CD16 単一ドメイン抗体の Fab をリンクによって設計されました。GPC3 S 工場は、大腸菌で発現し、2 つの親和性クロマトグラフィーで精製できます。精製 GPC3 S 工場は具体的にバインドし、肝臓癌治療における GPC3 S 工場の潜在的なアプリケーションを示唆しているナチュラル キラー細胞を募集して GPC3 陽性肝癌細胞を殺します。
Introduction
モノクローナル抗体はがん治療1今広く使用されています。抗体の柔軟性のため様々 な抗体基づかせていたフォーマットを積極的に検討しています。BsAbs は、モノクローナル抗体と比較して、2 つの異なるターゲット同時にかつ効率的にトリガーをターゲットし、腫瘍細胞2を殺す免疫エフェクター細胞の募集を認識し、それらを有効にする 2 つの異なる抗原結合モジュールがあります。
現在の組換え bsAb 形式は一般的に 2 つのクラスを割り当てることができます: Fc 含む bsAbs と Fc 領域なし bsAbs。主に哺乳類細胞で生成される Fc 含む形式と比較して、bsAbs なし Fc 領域より小さいサイズの利点がある微生物式システムでより容易に作り出される、腫瘍組織をより効率的に浸透することができます3。
Fc 領域なし bsAbs 一般的単一鎖可変断片 (scFvs) や Fab3などの個々 のバインディング部分をリンクすることによって形成されています。安定ドメインなし bsAbs scFv フラグメントに基づいて、多くの場合は熱安定性、低溶解度、または集計4、5の増加の可能性が侵害します。対照的に、工場ベース bsAbs はネイティブの Fab 部位4,6CH1 と CL の heterodimerization によるより安定しています。
重鎖だけ抗体 (VHHs、単一ドメイン抗体とも呼ばれます) から可変ドメインは、自然の重鎖抗体7のアクティブな抗原結合フラグメントです。VHHs 細菌の表現9に従来の Igg8、低免疫原性、高収率の特異性、親和性が高い特性があります。VHHs Fv 断片と比較して、高い熱安定性10があります。VHHs Fab 部分と比べると、CH1 と CL の不足のための小さいサイズがあります。したがって、S ・ Fab、単一ドメイン抗体、VHH、Fab をリンクすることによって得られる bsAb 形式を設計、その抗腫瘍効果11,12を勉強します。
本研究では抗 CD16a VHH14 hGC3313のファブをリンクすることにより GPC3 S 工場の建設が記述されていた。GPC3 S 工場は、エシェリヒア属大腸菌 (E. 大腸菌)のペリプラズム式で効率よく製作できます。GPC3 S 工場の機能調査は、GPC3 S Fab が肝臓癌療法のための有望な戦略であることを提案しました。したがって、簡単な生産と精製より安定した bsAbs 以前の研究に適用可能な参照を持つ代替技術上 GPC3 S 工場の利点があります。
哺乳類発現系と prokaryotic 表現システムは、BsAbs のさまざまな形式を表現するために使用されています。哺乳動物発現システム、大腸菌とは異なり-ベースのタンパク質発現系高収量、低コスト ・省力化、遺伝子操作と高変換効率15の容易さなど多くの利点があります。BsAbsエシェリヒア属大腸菌で、式の 2 つの基本的な戦略があります: 細胞質と細胞質と細胞膜の外側15ペリプラズムに式で表現します。細胞質の還元環境と比較して、ペリプラズムより酸化のフォールディングを促進する環境と共発現タンパク質16の。正しい折りたたみ bsAbs の溶解性、安定性、機能の生成に重要な役割を果たしています。したがって、信号シーケンス pelB はエシェリヒア属大腸菌の17のペリプラズムに分泌を直接に S 工場の N 末端に追加されました。確保するために、折りたたみ、溶解性、熱安定性、構造安定性、複雑さと抗体のサイズを減らすことは正しい頻繁16が採用。S ・ Fab 形式は 1 つの Fab と 1 つ VHH、小型、シンプルな構造により可能性のある細菌のシステムで非常によく表現されるから成っています。
GPC3 は、GPC3 S Fab バイスペシフィック抗体形式で選ばれました。グリピカン 3 (GPC3) 一種 (GPI)18を介して細胞表面に固定されているヘパリン硫酸 (HS) プロテオグリカン家族のメンバーであります。Gpc3 由来は肝臓癌19,20,21,22の大部分を占める肝細胞癌 (HCC) の場合の 70% の発現です。Gpc3 由来がほとんど表されるので正常組織には、gpc3 由来は肝細胞癌に対する潜在的なターゲットとして提案されています。GPC3 に対して複数のマウスのモノクローナル抗体を生産されています。GC33 のみ展示限定の抗腫瘍活性22, し、それは患者の臨床効果を示すことに失敗しました。本研究では GPC3 S 工場は14gpc3 由来腫瘍の細胞を殺す NK 細胞を募集できるように示されました。
NK 細胞を募集、抗 CD16 VHH を使用しました。CD16a は、低親和性 IgG 受容体、ナチュラル キラー (NK) 細胞、マクロファージ、単球、T 細胞のいくつかのサブタイプに主に表現されます。NK 細胞23細胞抗体依存性細胞傷害 (ADCC) にかかわる。ヒト NK 細胞は、CD56 の 2 種類に分類できます – CD16 + と CD56 + CD16-。CD56 + CD16− NK 細胞、CD56 と対照をなして-CD16 + NK 細胞はパーフォリンおよびグランザイム B の高いレベルを解放でき、したがって24強い細胞毒性を提示します。CD16a を表現するクッパー細胞 (KCs) は、肝マクロファージです。クッパー細胞は、肝臓癌25の抑制に重要な役割を果たします。したがって、ターゲット CD16a bsAbs より魅力的な肝臓がんに対する T 細胞より有望な戦略があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究で提案する bsAbs の書式を新規作成するための戦略 GPC3-S-ファブをターゲットに GPC3 陽性腫瘍細胞 NK 細胞を募集することができます。S 工場はすてきな自然に基づいて抗 CD16 VHH11,12を追加することによって形式。BsAbs 含む Fc 領域と比べると、GPC3 S Fab 簡単に大規模な細菌のペリプラズムで製造することができます。
プロト?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、R & D 計画の広東省 (中国) (2016A050503028) によって財政的に支えられました。
Materials
| Shaking incubator | Thermo Fisher | MAXQ 4000 | |
| Shaking incubator | Zhicheng | ZWYR-D2402 | |
| Centrifuge | Cence | GL-10MD | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Avanti j-26S XPI | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop | |
| Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Mini-PROTEAN® Tetra | Bio-rad | |
| Trans-blot apparatus | Criterion | Bio-rad | |
| Imaging system | Bio-rad | chemidoc tm XRS+ | |
| Fast Protein Liquid chromatogram | GE Healthcare | AKTA avant | |
| GF column | GE Healthcare | 28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL | |
| Flow Cytometer | Beckman coulter | FC500 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5702R | |
| Envision plate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| Anti His-tag | eBioscience | 14-6657-82 | |
| anti-Flag-tag | Sigma | F1804 | |
| anti-human(H&L)-488 | A11013 | Invitrogen | |
| Anti-mouse IgG HRP-linked antibody | Cell Signaling | 7076S | |
| Ni-NTA-Agarose | Tribioscience | TBS9202-100 | |
| IgG-CH1 affinity resin | Thermo Fisher | 194320005 | |
| Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| NK cell enrichment kit | Stemcell | 19055 | |
| Magnet | Stemcell | 18000 | |
| CCK8 kit | Dojindo | CK04 | |
| DMEM | Gibco | C11995500CP | |
| RPMI-1640 | Gibco | C11875500CP | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| Trypsin | Gibco | 15050-057 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture |
| Standard marker | Sigma Aldrich | MWGF200 | Gel filtration |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) | VWR chemicals | VWRC0487-100G | |
| Dialysis tubing | Sigma Aldrich | D0655-100FT | |
| Knanamycine | VWR | VWRC0408-100G | |
| Ampicillin | VWR | VWRC0339-100G | |
| Tryptone | Thermo Fisher | LP0042B | |
| Yeast Extract | Thermo Fisher | LP0021B | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T6791-1KG | |
| EDTA | Sigma Aldrich | V900106 | |
| Glycine | aladdin | A110752-500g | |
| KCl | aladdin | P112134-500g | |
| MgCl | Sigma Aldrich | V900020 | |
| Agar | Sangon Biotech | A505255-0250 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | VWR | 7778-77-0 | |
| Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4) | VWR | 7558-79-4 | |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 60-24-2 | |
| Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | VWR | 329-98-6 | |
| Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | VWR | VWRC0472-50G | |
| Bromophenol blue | Sangon Biotech | A500922-25G | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | VWRC0332-100G | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | V900122 | |
| 100mm x 20mm plastic dish | Corning | 430167 | |
| 25cm2 flask | Corning | 430639 | |
| 96 well cell culture cluster | Corning | 3599 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A610498-0005 | |
| CHO | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | GNHa 3 | |
| MHCC-97H | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | SCSP-528 | |
| HepG2 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu 72 | |
| Huh7 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu182 | |
| Hep3B | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu106 | |
| NK92 | ATCC | CRL2408 |
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