Aquí, presentamos un protocolo para producir un anticuerpo tienen GPC3-S-Fab en Escherichia coli. GPC3-S-Fab purificado tiene potente citotoxicidad contra las células de cáncer de hígado positivo GPC3.
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Artículo de método
Metas de GPC3 tienen anticuerpos, GPC3-S-Fab, con potente citotoxicidad
En este artículo
Resumen
Resumen
Este protocolo describe la construcción y estudios funcionales de un anticuerpo tienen (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs puede reconocer dos epitopos diferentes a través de sus dos brazos diferentes. bsAbs han sido estudiados activamente por su capacidad para contratar directamente a las células inmunes para matar las células tumorales. Actualmente, la mayoría de la bsAbs se produce en forma de proteínas recombinantes, como que contiene Fc bsAbs o como pequeños bsAb derivados sin la región Fc. En este estudio, GPC3-S-Fab, un anticuerpo de base tienen anticuerpos fragmento (Fab), fue diseñado por vincular la Fab del anticuerpo anti-GPC3 GC33 con un anticuerpo de anti-CD16 solo dominio. GPC3-S-Fab puede ser expresado en Escherichia coli y purificado de dos cromatografías de afinidad. GPC3-S-Fab purificado puede específicamente unirse a y matar a las células de cáncer de hígado positivo GPC3 reclutando células de asesino naturales, lo que sugiere una posible aplicación de GPC3-S-Fab en terapia de cáncer de hígado.
Introducción
Anticuerpos monoclonales se utilizan ampliamente para el tratamiento de cáncer1. Debido a la flexibilidad de los anticuerpos, se han explorado activamente varios formatos basados en anticuerpos. En comparación con los anticuerpos monoclonales, bsAbs tienen dos módulos de enlace de antígeno diferentes, lo que les permite reconocer dos objetivos diferentes simultáneamente y eficiente accionar el reclutamiento de las células efectoras inmunes para atacar y matar a las células de tumor2.
Formatos actuales bsAb recombinantes pueden ser asignados generalmente a dos clases: bsAbs que contiene Fc y bs....
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Protocolo
Todos los procedimientos incluyendo la colección de sangre humana fueron aprobados por el Comité de ética de Universidad de Yat-sensor del sol.
1. estrategia de diseño GPC3-S-Fab
- Diseño GPC3-S-Fab vinculando un Fab de anti-GPC3 (humanizado GC3313) con una anti-CD16 VHH14 (figura 1).
- Sintetizar y clonar el VH-CH1-CD16-VHH y VL-CL en los vectores pET26b y pET21a como previamente divulgados12.
2. transformación y cultura
- Añadir 100 ng de pET26b que contiene VH-CH1-CD16 (
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Resultados
Purificación de GPC3-S-Fab
GPC3-S-Fab fue purificada de e. coli por una purificación de la afinidad de dos etapas, primero con Ni-NTA-agarosa, seguido por la purificación de la afinidad de IgG-CH1. Después de la purificación de la afinidad de dos etapas, GPC3-S-Fab fue purificada a homogeneidad con las dos cadenas cerca de 1:1 (figura 2A). La presencia de polipéptidos VHH C.......
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Discusión
En este estudio, presentamos una estrategia para la construcción de un nuevo formato de la bsAbs, GPC3-S-Fab, que puede reclutar las células NK a las células del tumor positivo GPC3. S-Fab se basa en la Fab natural formato añadiendo una anti-CD16 VHH11,12. En comparación con la región de Fc que contienen bsAbs, GPC3-S-Fab puede fácilmente producir en el periplasma de bacterias en gran escala.
Utilizando la estrategia de expresión y pur.......
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Divulgaciones
Los autores no declaran conflictos de interés.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado financieramente por el R & D Plan de la provincia de Guangdong (PR China) (2016A050503028).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| incubadora de agitación | Thermo Fisher | MAXQ 4000 | |
| incubadora de agitación | Zhicheng | ZWYR-D2402 | |
| Centrífuga | Cence | GL-10MD | |
| Centrífuga | Beckman Coulter | Avanti J-26S Centrífuga XPI | |
| eppendorf | 5810R | ||
| Espectrofotómetro ultravioleta | Thermo Fisher | Nanodrop | |
| Aparato analítico de electroforesis en gel de poliacrilamida | Mini-PROTEAN® Aparato Tetra | Bio-rad | |
| Trans-blot | Criterion | Bio-rad Sistema de imagen Bio-rad | |
| chemidoc tm XRS+ | |||
| Fast Protein Cromatograma líquido | GE Healthcare | Columna AKTA avant | |
| GF | GE Healthcare | 28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL | |
| Citómetro de flujo | Beckman | Centrífuga FC500 | |
| eppendorf | 5702R | ||
| Envision lector de placas | TECAN | Infinite F50 | |
| Anti His-tag | eBioscience | 14-6657-82 | |
| anti-Flag-tag | Sigma | F1804 | |
| anti-humano (H& L)-488 | A11013 | Invitrogen | |
| Anticuerpo ligado a HRP IgG de ratón | Cell Signaling | 7076S | |
| Ni-NTA-Agarose | Tribioscience | TBS9202-100 | |
| IgG-CH1 resina de afinidad | Thermo Fisher | 194320005 | |
| Ficoll-Plaque Plus GE | Healthcare | 17-1440-03 | |
| Kit de enriquecimiento de células NK | Stemcell | 19055 | |
| Célula madre | magnética | 18000 | |
| CCK8 kit | Dojindo | CK04 | |
| DMEM | Gibco | C11995500CP | |
| RPMI-1640 | Gibco | C11875500CP | |
| Suero Fetal Bovino (FBS) | Sigma | F2442 | |
| Tripsina | Gibco | 15050-057 | |
| Penicilina-estreptomicina | Gibco | 15140-122 | Cultivo celular |
| Marcador patrón | Sigma Aldrich MWGF200 | Filtración en gel | |
| Isopropil-b-D-tio-galactopiranósido (IPTG) | Productos químicos de VWR | VWRC0487-100G | |
| Tubo de diálisis | Sigma Aldrich | D0655-100FT | |
| Knanamycina | VWR | VWRC0408-100G | |
| Ampicilina | VWR | VWRC0339-100G | |
| Triptona | Thermo Fisher | LP0042B | |
| Extracto de levadura | Thermo Fisher | LP0021B | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241 | |
| Trizma base | Sigma | Aldrich T6791-1KG | |
| EDTA | Sigma Aldrich | V900106 | |
| Glicina | aladdin | A110752-500g | |
| KCl | aladdin | P112134-500g | |
| MgCl | Sigma Aldrich V900020 | ||
| Agar | Sangon Biotech | A505255-0250 | |
| Fosfato de potasio, monobásico anhidro (KH2PO4) | VWR | 7778-77-0 | |
| Fosfato de sodio, dibásico, anhidro (Na2HPO4) | VWR | 7558-79-4 | |
| 2-Mercaptoetanol | VWR | 60-24-2 | |
| Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) | VWR | 329-98-6 | |
| Lisozima | Sigma Aldrich | L6876-25G | |
| Coomassie Azul Brillante R250 | VWR | VWRC0472-50G | |
| Azul de bromofenol | Sangon Biotech | A500922-25G | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | VWR | VWRC0332-100G | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | V900122 | |
| plato de plástico de 100 mm x 20 mm | Matraz de | ||
| Corning de 25 cm2 | Corning | 430639 | |
| clúster de cultivo celular de 96 pocillos | Corning | 3599 | |
| Sacarosa | Sangon Biotech | A610498-0005 | |
| CHO | La Colección de Cultura Tipo de la Academia China de Ciencias | GNHa 3 | |
| MHCC-97H | La Colección de Cultura Tipo de la Academia | SCSP-528 | |
| HepG2 | La Colección de Cultura Tipo de la Academia China de Ciencias | TCHu 72 | |
| Huh7 | La Colección de Cultura Tipo de la Academia China de Ciencias | TCHu182 | |
| Hep3B | la Colección de Cultura Tipo de la Academia China de Ciencias | TCHu106 | |
| NK92 | ATCC | CRL2408 |
Referencias
- Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
- Rathi, C., Meibohm, B. Clinical pharmacology of bispecific antibody constructs. The Journal of Clinical Pharmacology. 55, Suppl ....
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Reimpresiones y permisos
