Metas de GPC3 tienen anticuerpos, GPC3-S-Fab, con potente citotoxicidad
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para producir un anticuerpo tienen GPC3-S-Fab en Escherichia coli. GPC3-S-Fab purificado tiene potente citotoxicidad contra las células de cáncer de hígado positivo GPC3.
Abstract
Este protocolo describe la construcción y estudios funcionales de un anticuerpo tienen (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs puede reconocer dos epitopos diferentes a través de sus dos brazos diferentes. bsAbs han sido estudiados activamente por su capacidad para contratar directamente a las células inmunes para matar las células tumorales. Actualmente, la mayoría de la bsAbs se produce en forma de proteínas recombinantes, como que contiene Fc bsAbs o como pequeños bsAb derivados sin la región Fc. En este estudio, GPC3-S-Fab, un anticuerpo de base tienen anticuerpos fragmento (Fab), fue diseñado por vincular la Fab del anticuerpo anti-GPC3 GC33 con un anticuerpo de anti-CD16 solo dominio. GPC3-S-Fab puede ser expresado en Escherichia coli y purificado de dos cromatografías de afinidad. GPC3-S-Fab purificado puede específicamente unirse a y matar a las células de cáncer de hígado positivo GPC3 reclutando células de asesino naturales, lo que sugiere una posible aplicación de GPC3-S-Fab en terapia de cáncer de hígado.
Introduction
Anticuerpos monoclonales se utilizan ampliamente para el tratamiento de cáncer1. Debido a la flexibilidad de los anticuerpos, se han explorado activamente varios formatos basados en anticuerpos. En comparación con los anticuerpos monoclonales, bsAbs tienen dos módulos de enlace de antígeno diferentes, lo que les permite reconocer dos objetivos diferentes simultáneamente y eficiente accionar el reclutamiento de las células efectoras inmunes para atacar y matar a las células de tumor2.
Formatos actuales bsAb recombinantes pueden ser asignados generalmente a dos clases: bsAbs que contiene Fc y bsAbs sin una región Fc. En comparación con formatos que contienen el Fc que se producen sobre todo en células de mamíferos, bsAbs sin una región Fc tienen las ventajas de menor tamaño, se producen más fácilmente en sistemas de expresión de microorganismos y puede penetrar los tejidos del tumor más eficientemente 3.
bsAbs sin una región Fc comúnmente se forman uniendo partes de enlace individuales, tales como fragmentos de variable de cadena simple (scFvs) o Fab3. Sin los dominios estabilizadoras bsAbs basados a menudo en fragmentos scFv han comprometido estabilidad térmica, baja solubilidad y un potencial aumento de agregación4,5. En cambio, son más estables debido al heterodimerization de CH1 y CL en la parte nativa de la Fab4,6bsAbs basada en Fab.
Dominio variable de la pesado-cadena-sólo anticuerpos (VHHs, también conocidos como anticuerpos de dominio único) es el fragmento de unión a antígeno activado de anticuerpos de cadena pesada natural7. VHHs tiene las características de alta afinidad, especificidad de IgGs convencionales8, inmunogenicidad baja y altos rendimientos en expresión bacteriana9. En comparación con fragmentos Fv, VHHs tienen mayor estabilidad térmica10. En comparación con fracciones Fab, VHHs tienen tamaños más pequeños debido a la falta de CH1 y CL. Por lo tanto, S-Fab, el formato bsAb obtenido mediante la vinculación de la Fab con un anticuerpo de dominio único, VHH, fue diseñado y estudiado por sus efectos antitumorales11,12.
En este estudio, se describe la construcción de GPC3-S-Fab vinculando la Fab de hGC3313 con un anti-CD16a VHH14 . La Fab GPC3-S puede producir eficientemente por periplasmic expresión en Escherichia coli (e. coli). Estudios funcionales de GPC3-S-Fab sugieren que GPC3-S-Fab es una estrategia prometedora para el tratamiento de cáncer de hígado. Así, las ventajas de GPC3-S-Fab sobre técnicas alternativas con referencias aplicables a estudios anteriores incluyen fácil producción y purificación y más estable bsAbs.
Sistemas de expresión mamífero y sistemas de expresión procariotas se han utilizado para expresar diversos formatos de la BsAbs. En contraste con sistemas de expresión mamífero, e. coli-sistemas de expresión de proteínas en base tienen muchos beneficios, incluyendo alto rendimiento, bajo costo y ahorro de trabajo, la facilidad de manipulación genética y transformación alta eficiencia15. Para la bsAbs expresión en e. coli, hay dos estrategias básicas: expresión en el citoplasma y la expresión en el periplasma entre el citoplasma y el exterior de las membranas celulares15. Comparado con el ambiente reductor del citoplasma, el periplasma es un oxidante más ambiente, que promueve el correcto plegamiento y coexpresión de proteínas16. Plegamiento correcto juega un papel clave en la generación de solubilidad, la estabilidad y la función de la bsAbs. Por lo tanto, ha añadido un pelB de secuencia señal N-terminal de la S-Fab para dirigir la secreción en el periplasma de e. coli17. Para asegurar correcto plegamiento, solubilidad, estabilidad térmica y estabilidad conformacional, reduciendo la complejidad y el tamaño de un anticuerpo es empleado con frecuencia16. El formato S-Fab consta de una fabulosa y un VHH, que se expresa muy bien en sistemas bacterianos probablemente debido a la estructura simple y tamaño pequeño.
GPC3 fue elegido en este formato de anticuerpo tienen GPC3-S-Fab. Glypican-3 (GPC3) es un miembro de la familia de proteoglicanos de sulfato (HS) de heparina que está anclada a la superficie de la célula a través de glicosilfosfatidilinositol (GPI)18. GPC3 es sobreexpresada en el 70% de los casos de carcinoma (HCC) hepatocelular, que representan la mayoría de los cánceres del hígado19,20,21,22. Porque GPC3 raramente se expresa en los tejidos normales, GPC3 se ha propuesto como un objetivo potencial para el CHC. Se han producido múltiples ratón mAbs contra GPC3. Sin embargo, sólo GC33 exhiben actividad antitumoral limitada 22y no pudo exhibir la eficacia clínica en pacientes. En este estudio, GPC3-S-Fab fue demostrado para ser capaz de reclutar las células NK para matar GPC3 tumor células14.
Para reclutar a las células NK, se utilizó anti-CD16 VHH. CD16a es un receptor de IgG de baja afinidad, expresado principalmente en las células natural killer (NK), macrófagos, monocitos y algunos subtipos de células T. Está implicado en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CMCDA) por las células NK23. Las células NK humanas pueden clasificarse en dos tipos, CD56 – CD16 + y CD16 + CD56-. En contraste con las células NK CD56 + CD16−, CD56-las células NK CD16 + pueden liberar niveles más altos de perforin y granzyme B y así presentan una citotoxicidad fuerte24. Las células de Kupffer (KCs), expresando CD16a, son los macrófagos residentes en el hígado. Las células de Kupffer juegan un papel importante en la supresión del cáncer de hígado25. Así, la bsAbs targeting CD16a puede ser una estrategia más prometedora que la participación de células T contra el cáncer de hígado.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, presentamos una estrategia para la construcción de un nuevo formato de la bsAbs, GPC3-S-Fab, que puede reclutar las células NK a las células del tumor positivo GPC3. S-Fab se basa en la Fab natural formato añadiendo una anti-CD16 VHH11,12. En comparación con la región de Fc que contienen bsAbs, GPC3-S-Fab puede fácilmente producir en el periplasma de bacterias en gran escala.
Utilizando la estrategia de expresi?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado financieramente por el R & D Plan de la provincia de Guangdong (PR China) (2016A050503028).
Materials
| Shaking incubator | Thermo Fisher | MAXQ 4000 | |
| Shaking incubator | Zhicheng | ZWYR-D2402 | |
| Centrifuge | Cence | GL-10MD | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Avanti j-26S XPI | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop | |
| Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Mini-PROTEAN® Tetra | Bio-rad | |
| Trans-blot apparatus | Criterion | Bio-rad | |
| Imaging system | Bio-rad | chemidoc tm XRS+ | |
| Fast Protein Liquid chromatogram | GE Healthcare | AKTA avant | |
| GF column | GE Healthcare | 28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL | |
| Flow Cytometer | Beckman coulter | FC500 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5702R | |
| Envision plate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| Anti His-tag | eBioscience | 14-6657-82 | |
| anti-Flag-tag | Sigma | F1804 | |
| anti-human(H&L)-488 | A11013 | Invitrogen | |
| Anti-mouse IgG HRP-linked antibody | Cell Signaling | 7076S | |
| Ni-NTA-Agarose | Tribioscience | TBS9202-100 | |
| IgG-CH1 affinity resin | Thermo Fisher | 194320005 | |
| Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| NK cell enrichment kit | Stemcell | 19055 | |
| Magnet | Stemcell | 18000 | |
| CCK8 kit | Dojindo | CK04 | |
| DMEM | Gibco | C11995500CP | |
| RPMI-1640 | Gibco | C11875500CP | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| Trypsin | Gibco | 15050-057 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture |
| Standard marker | Sigma Aldrich | MWGF200 | Gel filtration |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) | VWR chemicals | VWRC0487-100G | |
| Dialysis tubing | Sigma Aldrich | D0655-100FT | |
| Knanamycine | VWR | VWRC0408-100G | |
| Ampicillin | VWR | VWRC0339-100G | |
| Tryptone | Thermo Fisher | LP0042B | |
| Yeast Extract | Thermo Fisher | LP0021B | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T6791-1KG | |
| EDTA | Sigma Aldrich | V900106 | |
| Glycine | aladdin | A110752-500g | |
| KCl | aladdin | P112134-500g | |
| MgCl | Sigma Aldrich | V900020 | |
| Agar | Sangon Biotech | A505255-0250 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | VWR | 7778-77-0 | |
| Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4) | VWR | 7558-79-4 | |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 60-24-2 | |
| Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | VWR | 329-98-6 | |
| Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | VWR | VWRC0472-50G | |
| Bromophenol blue | Sangon Biotech | A500922-25G | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | VWRC0332-100G | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | V900122 | |
| 100mm x 20mm plastic dish | Corning | 430167 | |
| 25cm2 flask | Corning | 430639 | |
| 96 well cell culture cluster | Corning | 3599 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A610498-0005 | |
| CHO | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | GNHa 3 | |
| MHCC-97H | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | SCSP-528 | |
| HepG2 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu 72 | |
| Huh7 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu182 | |
| Hep3B | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu106 | |
| NK92 | ATCC | CRL2408 |
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