Ein GPC3-targeting Bispezifische Antikörper, GPC3-S-Fab, mit potenten Zytotoxizität
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine bispezifische Antikörper GPC3-S-Fab in Escherichia coli. Die gereinigte GPC3-S-Fab hat potente Zytotoxizität gegen GPC3 positive Leberkrebs Zellen.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt den Bau und die funktionelle Studien ein bispezifische Antikörper (BsAb), GPC3-S-Fab. BsAbs erkennt man zwei verschiedene Epitope durch ihre zwei verschiedenen Waffen. BsAbs sind aktiv für ihre Fähigkeit, direkt rekrutieren Immunzellen zu töten Tumorzellen untersucht worden. Gegenwärtig werden die meisten BsAbs in Form von rekombinanten Proteinen, Fc-haltigen BsAbs oder als kleiner BsAb Derivate ohne die Fc-Region hergestellt. In dieser Studie wurde GPC3-S-Fab, ein Antikörper-Fragment (Fab) basierte bispezifische Antikörper, durch die Verknüpfung der Fab Anti-GPC3 Antikörper GC33 mit einem Anti-CD16 Einzeldomäne Antikörper entwickelt. GPC3-S-Fab werden in Escherichia coli ausgedrückt und durch zwei Affinität Chromatographies gereinigt. Die gereinigte GPC3-S-Fab kann speziell an binden und Krebszellen töten GPC3 positive Leber durch die Rekrutierung von natürlichen Killerzellen, was auf eine mögliche Anwendung der GPC3-S-Fab in Leberkrebs-Therapie.
Introduction
Monoklonale Antikörper dienen heute im großen und ganzen für Krebs Behandlung1. Aufgrund der Flexibilität der Antikörper wurden verschiedene Antikörper-basierte Formate aktiv untersucht. Im Vergleich mit monoklonalen Antikörpern, haben BsAbs zwei verschiedene Antigen Bindung Module, damit sie erkennen, dass zwei verschiedene Ziele gleichzeitig und effizient lösen die Rekrutierung von immun-Effektorzellen und Tumor Zellen2töten.
Aktuelle rekombinante BsAb Formate können in der Regel zwei Klassen zugeordnet werden: Fc-haltigen BsAbs und BsAbs ohne eine Fc-Region. Verglichen mit Fc-haltigen Formate, die meist in Säugerzellen hergestellt werden, BsAbs ohne eine Fc-Region haben die Vorteile der kleineren Größen sind leichter im Mikroorganismus Expressionssysteme produziert, und dringen Tumorgewebe effizienter 3.
BsAbs ohne eine Fc-Region entstehen häufig durch die Verknüpfung von einzelnen verbindlichen Moieties, wie Single-Chain Variable Fragmente (ScFvs) oder Fabs3. Ohne die stabilisierenden Domänen kompromittiert BsAbs basierend auf ScFv-Fragmenten oft thermische Stabilität, geringe Löslichkeit oder ein erhöhtes Potenzial für Aggregation4,5. Im Gegensatz dazu sind Fab-basierte BsAbs stabiler aufgrund der Heterodimerization der CH1 und CL in der nativen Fab Glyko-4,6.
Variable Domäne aus Heavy-Kette-nur Antikörper (Fhkw, auch als Einzeldomäne Antikörper bezeichnet) sind die aktiven Antigen-bindenen Fragment der natürliche schwere Kette Antikörper7. Fhkw haben die Eigenschaften der hohen Affinität, Spezifität von konventionellen IgGs8, niedrige Immunogenität und hohe Erträge in bakteriellen Ausdruck9. Fhkw haben höhere thermische Stabilität10gegenüber den Fv Fragmente. Fhkw haben gegenüber den Fab Moieties kleinere Größen aufgrund des Fehlens von CH1 und CL. So war S-Fab, gewonnen durch die Verknüpfung der Fab mit einer Einzeldomäne Antikörper, LHKW, BsAb-Format konzipiert und studierte für seine Anti-Tumor-Effekte11,12.
In dieser Studie wurde der Bau des GPC3-S-Fab durch die Verknüpfung der Fab hGC3313 mit einer Anti-CD16a LHKW14 beschrieben. Die GPC3-S-Fab kann effizient durch periplasmatischen Ausdruck in Escherichia coli (E. Coli)produziert werden. Funktionelle Studien von GPC3-S-Fab vorgeschlagen, dass GPC3-S-Fab eine vielversprechende Strategie für Leberkrebs-Therapie. So gehören die Vorteile der GPC3-S-Fab über alternative Techniken mit gültigen Verweise auf frühere Studien einfache Produktion und Reinigung und stabiler BsAbs.
Säugetier-Expressionssysteme und prokaryotischen Expressionssysteme wurden zur verschiedene Formate von BsAbs zum Ausdruck bringen. Im Gegensatz zu Säugetieren Expressionssysteme, E. Coli-basierte Protein Expressionssysteme haben viele Vorteile, einschließlich hohe Erträge, low-cost und arbeitssparend, die einfache genetische Manipulationen und hohe Umwandlung Leistungsfähigkeit15. Für die BsAbs Expression in E. Coli, gibt es zwei grundlegende Strategien: Ausdruck im Zytoplasma und Ausdruck in das Periplasma zwischen dem Zytoplasma und dem äußeren Zellmembranen15. Im Vergleich zu den reduzierenden Umgebung des Zytoplasma, ist das Periplasma ein mehr oxidierende Umgebung, die fördert die korrekte Faltung und Co Expression von Proteinen16. Korrekte Faltung spielt eine Schlüsselrolle in der Löslichkeit, Stabilität und Funktion Generation von BsAbs. Daher wurde ein Signal Sequenz PelB der N-Terminus von S-Fab Sekretion, das Periplasma von E. Coli17direkt hinzugefügt. Um sicherzustellen beschäftigt korrekte Faltung, Löslichkeit, thermische Stabilität und conformational Stabilität, reduzieren die Komplexität und die Größe eines Antikörpers ist häufig16. Das S-Fab-Format besteht aus einem Fab und einem LHKW, die im bakteriellen Systemen wahrscheinlich aufgrund der einfachen Struktur und der geringen Größe sehr gut zum Ausdruck kommt.
GPC3 wurde in diesem GPC3-S-Fab bispezifische Antikörper Format gewählt. Glypican-3 (GPC3) ist ein Mitglied der Heparin-Sulfat (HS)-Proteoglykan-Familie, die an der Zelloberfläche durch glycosylphosphatidylinositole (GPI)18verankert ist. GPC3 ist in 70 % der hepatozellulären Karzinom (HCC) Fällen, welches Konto für die Mehrheit der Leberkrebs19,20,21,22überexprimieren. Da GPC3 selten in normalen Geweben ausgedrückt wird, ist GPC3 als ein potenzielles Ziel für HCC vorgeschlagen worden. Mehrere Maus-mAbs wurden gegen GPC3 produziert. Jedoch nur GC33 stellte begrenzte Anti-Tumor-Aktivität 22und es versäumt, die klinischen Wirksamkeit bei Patienten aufweisen. In dieser Studie zeigte sich GPC3-S-Fab, NK-Zellen zu töten GPC3 Tumor Zellen14rekrutieren zu können.
NK-Zellen zu rekrutieren, wurde Anti-CD16 LHKW verwendet. CD16a ist eine geringe Affinität IgG-Rezeptor, vor allem auf einige Subtypen von T-Zellen, Monozyten und Makrophagen, natürliche Killerzellen (NK) ausgedrückt. Sie engagiert sich in Antikörper-abhängige Zelle Zytotoxizität (ADCC) von NK-Zellen-23. Menschlichen NK-Zellen können unterteilt werden in zwei Typen, CD56 – CD16 + / CD56 + CD16. Im Gegensatz zu CD56 + CD16− NK-Zellen, CD56-CD16 + NK-Zellen können höhere Perforin und granzym B lösen und damit eine starke Zytotoxizität24. Kupffer Zellen (KCs), mit dem Ausdruck CD16a, sind die Bewohner Makrophagen in Leber. Kupffer Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Unterdrückung von Leberkrebs25. So kann gezielt CD16a BsAbs eine viel versprechende Strategie als Beteiligung von T-Zellen gegen Leberkrebs sein.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie präsentieren wir eine Strategie, um ein neues Format von BsAbs, konstruieren GPC3-S-Fab, die NK-Zellen GPC3 positive Tumorzellen gezielt rekrutieren kann. Die S-Fab basiert auf der natürlichen Fab Format durch das Hinzufügen einer Anti-CD16 LHKW11,12. Im Vergleich mit der BsAbs enthaltenden Fc Region, kann GPC3-S-Fab leicht in das Periplasma von Bakterien in großem Maßstab hergestellt werden.
Mit der im Protokoll …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der R & D Planen der Provinz Guangdong (VR China) (2016A050503028) finanziell unterstützt.
Materials
| Shaking incubator | Thermo Fisher | MAXQ 4000 | |
| Shaking incubator | Zhicheng | ZWYR-D2402 | |
| Centrifuge | Cence | GL-10MD | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Avanti j-26S XPI | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop | |
| Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Mini-PROTEAN® Tetra | Bio-rad | |
| Trans-blot apparatus | Criterion | Bio-rad | |
| Imaging system | Bio-rad | chemidoc tm XRS+ | |
| Fast Protein Liquid chromatogram | GE Healthcare | AKTA avant | |
| GF column | GE Healthcare | 28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL | |
| Flow Cytometer | Beckman coulter | FC500 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5702R | |
| Envision plate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| Anti His-tag | eBioscience | 14-6657-82 | |
| anti-Flag-tag | Sigma | F1804 | |
| anti-human(H&L)-488 | A11013 | Invitrogen | |
| Anti-mouse IgG HRP-linked antibody | Cell Signaling | 7076S | |
| Ni-NTA-Agarose | Tribioscience | TBS9202-100 | |
| IgG-CH1 affinity resin | Thermo Fisher | 194320005 | |
| Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| NK cell enrichment kit | Stemcell | 19055 | |
| Magnet | Stemcell | 18000 | |
| CCK8 kit | Dojindo | CK04 | |
| DMEM | Gibco | C11995500CP | |
| RPMI-1640 | Gibco | C11875500CP | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| Trypsin | Gibco | 15050-057 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture |
| Standard marker | Sigma Aldrich | MWGF200 | Gel filtration |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) | VWR chemicals | VWRC0487-100G | |
| Dialysis tubing | Sigma Aldrich | D0655-100FT | |
| Knanamycine | VWR | VWRC0408-100G | |
| Ampicillin | VWR | VWRC0339-100G | |
| Tryptone | Thermo Fisher | LP0042B | |
| Yeast Extract | Thermo Fisher | LP0021B | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T6791-1KG | |
| EDTA | Sigma Aldrich | V900106 | |
| Glycine | aladdin | A110752-500g | |
| KCl | aladdin | P112134-500g | |
| MgCl | Sigma Aldrich | V900020 | |
| Agar | Sangon Biotech | A505255-0250 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | VWR | 7778-77-0 | |
| Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4) | VWR | 7558-79-4 | |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 60-24-2 | |
| Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | VWR | 329-98-6 | |
| Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | VWR | VWRC0472-50G | |
| Bromophenol blue | Sangon Biotech | A500922-25G | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | VWRC0332-100G | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | V900122 | |
| 100mm x 20mm plastic dish | Corning | 430167 | |
| 25cm2 flask | Corning | 430639 | |
| 96 well cell culture cluster | Corning | 3599 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A610498-0005 | |
| CHO | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | GNHa 3 | |
| MHCC-97H | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | SCSP-528 | |
| HepG2 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu 72 | |
| Huh7 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu182 | |
| Hep3B | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu106 | |
| NK92 | ATCC | CRL2408 |
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