Summary
Genetik varyantların karmaşık insan hastalığa katkıda kimliği roman mekanizmalar belirlemek için bize izin verir. Burada, biz aday genler veya kapsamı düşük maliyetle en üst düzeye çıkarır ve kohort-esaslı çalışmalar için mükellef gen yolu çözümlemesi için bir multiplex Genotipleme yaklaşım göstermektedir.
Abstract
Karmaşık hastalıklar genellikle hastalığı duyarlılık katkıda birden çok ortak genetik varyantların tarafından desteklenen. Burada, gen yolu kurum içinde klinik tabur araştırmak için kütle spektrometresi ile çoğaltılmış Genotipleme tahlil kullanarak bir düşük maliyetli etiket tek nükleotit polimorfizmi (SNP) yaklaşım tarif. Örnek olarak gıda Anti aday locus Interleukin13 (IL13) araştırıyoruz. Bu yöntem etkili bir şekilde kapsama bir bölge içinde paylaşılan bağlantı dengesizliği (LD) yararlanarak en üst düzeye çıkarır. Seçili LD SNPs sonra çoğaltılmış bir tahlil içine aynı anda, çözümlenmesi 40 farklı SNPs etkinleştirme maliyet-etkililik artırılması tasarlanmıştır. Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) Tek nükleotid uzantısı tarafından takip hedef loci yükseltmek için kullanılır ve amplicons sonra matris yardımlı Lazer Desorpsiyon/iyonlaşma-saati flight(MALDI-TOF) kütle spektrometresi kullanılarak ölçülür. Ham çıktı kalite kontrol mekanizması uygulamaktayız tanımları ve kesintileri, kullanarak yazılım, arama genotip ile analiz edilir ve yüksek olasılık genotip tespit ve veri analizi için çıkış.
Introduction
İnsan karmaşık hastalığında genetik varyantların hastalığı duyarlılık katkıda bulunmak ve bu çeşitleri miktarının yüksek riskli hasta grupları ve tedavi cevaplama tanımlama anlayış Escherichia türleri için yararlı olabilir. Gerçekten de, Allah'ın hassas tıp hasta alt gruplar1tanımlamak için genomik bilgi kullanan üzerine bağlıdır. Ne yazık ki, nereye hastalığı fenotipleri önemli genetik heterojenite, düşük alellerle ve değişken expressivity tarafından desteklenen, karmaşık hastalık biyoloji alanlarında kohort boyutu roman tanımlamak genom çapında yaklaşımlar için gereksinimleri adayların çoğu kez aşırı derecede büyük2. Alternatif olarak, bir hedef aday gen yaklaşım belirli genler/yolları hastalığı nedenleri3hakkında bir priori bir hipotez ile başlar. Yolu analiz araçları keşfedilmeyi çok sayıda aday yolları üreten bir tanımlanan hedef loci Patofizyoloji araştırmak için yaygın olarak kullanılır. Biz burada onlarca yüzlerce insan kohort çalışmaları4' e uygun bir tahlil ile SNPs incelenmesi için izin veren bir çoğaltılmış Genotipleme yaklaşım göstermektedir. Bu nispeten yüksek aracılığıyla-yüzlerce Roman keşif çalışmaları için genotyped olmak için DNA örnekleri binlerce ve belirli yolları incelenmesi için izin yerine, yaklaşımdır. Burada özetlenen yöntemleri nispeten hızlı ve ucuz bir şekilde tanımlayıcı risk alelleri ve klinik özellikleri ile dernekler için yararlıdır. Bu platform mikrobiyal enfeksiyon7 ve insan papilloma virüsü8için eleme ve tanılama amacıyla5,6ve son zamanlarda, daha fazlası için çok avantajlı oldu.
Bu iletişim kuralı için soruşturma, yanigen kümesi yelpazesi ile başlar., genellikle edebiyat arama veya bir priori hipotezler hastalık süreci; katılımı için belirlenen hedef bölgeleri ya da belki de bir keşif genom çapında Derneği (GWA) çalışmanın önde gelen dernek olarak çoğaltma için seçilmiş. Gen kümesinden araştırmacı etiketi SNPs rafine bir listesini seçer. Diğer bir deyişle, bağlantı dengesizliği (LD) veya türevleri bölge arasında korelasyon SNPs yüksek LD, bir haplogrubundan bilinen bir grup için bir temsilci 'Etiket SNP' tanımlamak için kullanılır. Bölgenin yüksek LD Genotipleme bir SNP haplogrubundan tüm SNPs, varyasyon temsil etmek yeterli olacak SNPs kez birlikte devralınacağı anlamına gelir. Alternatif olarak, Eğer çok sayıda bölgelerden, e.gSNPs kesin listesini takip., çoğaltma bir GWA çalışma için bu işlemi gereksiz olabilir. Çoğaltılmış Genotipleme için bir tahlil sonra bu hedefler öyle ki kitle bu uzantısı astar için farklı amplifikasyon astar vardır ve yorumlanabilir üretmek için ürünler spectra kitle tasarlanması gerekir. Bu parametreler bir çoğaltılmış Genotipleme tahlil tasarım aracı tarafından kolayca uygulanabilir. Bu tasarım ileriye ve geriye doğru astar faiz işaretleri hedef ve SNP içeren sıra yükseltmek için kullanılır. Uzantısı astar doğrudan SNPs proksimal iliştirin ve SNP için tamamlayıcı bir tek, kitle-modified, 'Terminatör' tabanı eklenir. Sonlandırıcı Bankası daha fazla DNA'ın uzantısı engeller. Kütle spektrometresi tarafından algılanması için tek bir Bankası tarafından farklı parçaları Bankası kütle değişimini sağlar. Genotipleme Kimya içeren plaka sonra bir çip bir kütle spektrometresi platformda ölçüm için uygulanır. Uygun kalite kontrol sistem tarafından algılanan ham Genotipleme aramaları uygulandıktan sonra veri ihraç ve hastalık fenotipleri ile ilişkisi için sınamak için istatistiksel analiz için kullanılan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada kullanılan genetik materyal etik kullanım için ofise için çocuk HREC (insan Araştırma Etik Komitesi) (CDF/07/492), insan Hizmetleri HREC bölümü kabul edildi (10/07) ve Royal Children's Hospital (RCH) HREC (27047).
1. çoğaltılmış tahlil tasarlama
- SNP listesini tahlil tasarımı için hazır olun.
- Hedef bölge Haploview (https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads) tagger işlevi girdi. LD (korelasyon, r2) arasında hedef bölgesi kapsayan SNPs gerekli türevleri en az sayıda ile istenen bölgesinin tam kapsama alanı sağlar SNPs, listesini oluşturmak için kullanın. Öyle ki yakalanması için tüm allelleri bir Kullanıcı tanımlı eşik correlated SNPs listesini oluşturmak (Örn., r2 ≥0.8).
- İleri, geri ve uzantısı astar için uygun sıralarını tanımlaması
- SNPs oluşturulan liste seçim tahlil tasarım aracı girin.
Not: Aşağıdaki talimatlar tahlil tasarım aracı Tablo reçetesibelirtildiği gibi temsilcisi sonuçlar üretmek için kullanılan geçerli. - Bir kez başlatılan tahlil tasarım aracı, Yeni Genotipleme tasarımıseçin. Tasarım ad alanına tahlil tasarımı için bir ad girin.
- 1.1.1. adımda Metin girişi düzenleme yönergeleri ile rs veya FASTA düğmesinin solunda düğmesini tıklatarak oluşturulan SNP listesi sağlamak.
Not: SNPs edilebilir başvuru (rs) SNP kimlikleri bir metin listesi olarak girilen veya FASTA biçiminde tarih veya araç tarafından SNP grup dosya biçimi kullanılır. Bu biçimlerdeki dosyaları yüklemek için Dosya Yükle düğmesini seçin. Üst 'iyi' olarak adlandırdığı bir tek tahlil içine tasarlanmış değişik 40 SNPs sınırıdır. Çalıştır başlamadan önce önceliğimizdir tasarımı için SNPs belirtmek mümkündür; Bunlar-ecek var olmak ressam ilk. Denetim SNPs belirtilebilir: Örneğin, cinsiyet örnek mix ups veya bu yeterli şablonu belirlemek için bir denetim durumunda algılamak için bir tahlil eklendi düşük veya fakir kalite DNA'sı ile çalışıyormuş. Ancak, denetim ve öncelik SNPs kullanarak tek bir iyi tasarlanmış SNPs sayısını azaltabilir unutulmamalıdır. - Hazır ayarı menüsünden yüksek çoğullama iPLEX hazır ayarı seçeneğini belirleyin. Organizma menüde genotyped olmak için DNA türetir içinden organizma. Burada sunulan temsilcisi sonuçları için bu insan oldu.
Not: Fare ve sığır organizmalar da aracı ile uyumludur. Ayrıca diğer bitki veya mikrop gibi alternatif bir organizma ile çalışıyorsanız birini seçebilirsiniz; Ancak, proksimal SNPs ve en uygun astar alanları bulmak için otomatik adımları başvuru genom yokluğu nedeniyle kullanılamaz. - Veritabanı menüsünde genom en son sürüme veya gerekirse, Kimya menüsünden alternatif bir yapı seçin. İPLEX seçin ve Çok katmanlı düzeyi alanı için çoğullama en yüksek düzeyini girin: 40. Şimdi, Başlamak Çalıştır' ı seçin. "Adım 1" aracının başlayacaktır.
Not: Adım 1 sırasında araç alır ve SNP dizileri biçimlendirir. Burada, hataları hangi durumda FASTA dosya olmalı kontrol ve gerektiğinde yeniden biçimlendirilmiş ve FASTA dosyasını biçimlendirme içerebilir. Başka bir hata birleştirilmiş SNP rs hangi durumda rs numarası SNP veritabanı yeni SNP rs numarasını belirlemek için NCBI'ın dbSNP gibi aranması bir başka rs numarasıyla rakamıdır. SNP çevresinde dizileri ile astar tasarım engelleyebilir bilinen herhangi bir proksimal SNPs aranır. Potansiyel PCR astar siteleri non-spesifik amplifikasyon genom içinde birden fazla isabet nedeniyle önlemek için genom karşı karşılaştırılır. - "Adım 2" proksimal SNPs belirlenecektir tasarım aracı / tamamlanması bekliyor.
Not: Bu bilgi varsa bu adımı tarafından desteklenmeyen bir organizma kullanıyorsanız, IUPAC Not içinde proksimal SNPs sıralarıyla açıklama ekleyin. Nadiren bu adımı sırasında hataları vardır; Ancak, hataları yanlış başvuru organizma veya genom seçiliyse veya genomik DNA yerine cDNA dizileri girdiyseniz meydana gelebilir. Adım 2, Gelişmiş ayarlar, en iyi duruma getirmek için belirli bir nüfus içinde çalışıyorsanız bir nüfusu temel alarak SNPs filtrelemek mümkündür. Nadir SNPs Ayrıca bir frekans % 1 aşağıda olanlar hariç tutarak filtre uygulanabilir. Son olarak, doğrulanmış bir durum var mı veya nüfus bilgileri var mı SNPs istenirse de dışlabilir. - "Adım 3" en uygun astar tanımlayan tasarım aracı / bölgeler tamamlanması bekliyor. Astar konumu tanımlanmamıştır tercih veya farklı bir organizma ile çalışıyorsanız, el ile astar mekanlar giriş dizisi (SNP grup dosyaları) ek açıklama ekleme tarafından tercih edilen astar bölgeler büyük harfli ve alt sırada kalan giriş Case, select Korumak durumunda Bu adım için Gelişmiş ayarlar menüsünden.
Not: Adım 2 ve 3 için hataları içerebilir: (1) A proksimal SNP bir astar tasarım şablonu tabanı ile maske ve bir oligo Isonine gibi evrensel bir tabanı ile sipariş veya her Zi gen ile iki astar tasarım için varlık çözümü ile engelleme Al SNP veya tasarım bir astar ile ortak alleli sadece. (2) başka bir yaygın hata astar için benzersiz bir site benzersiz bir site tanımlamak için amplicon uzunlukta değiştirmeye olmak çözüm ile tanımlamak için başarısız olduğunu. Bu kağıt için kullanılan Aracı'nda, 80-120 bp varsayılandır. Bu gelişmiş ayarlar diyalog "3. Amplicon uzunluk ayarı altında 60-400 bp den değiştirilebilir En uygun astar alanları belirlemek"ve aynı zamanda sekmesi altında yer alan Amplicon "4. Tasarım deneyleri." Her ikisi de değiştirilir emin olun. Ancak, kullanarak DNA bozulmuş amplicon uzunluğunu artırma tavsiye edilmez unutulmamalıdır. - Tahlil tasarım adım ("Adım 4" tasarım aracı) tamamlanması bekliyor, burada aracı uzantısı astar ve çoğaltılmış tasarımlarında bütün SNPs alelleri arasında en iyi pass ayrılık sağlamayı amaçlamaktadır. Bu adım tamamlandıktan sonra seçtiğiniz satıcı sipariş bir oligo kolay sipariş vermek için biçimlendirilmiş Oligo sıra dosyası dışa aktarın.
Not: Amplifikasyon astar (ileri (F) ve (R) ters) 80-120 en uygun amplicon boyutunu üretmek için tasarlanmıştır bp. Amplifikasyon astar gerekir kitle farklı uzantı astar ve kütle spektrumu böylece genel PCR performansı için çakışan sonuçları önlemek için ürün. Uzantısı astar 3' ucu çok biçimlilik sitesine bitişik eklemek olacaktır tasarlanmıştır 15 ila 30 nükleotit uzun (4.500-9.000 Da) olmalıdır. Bu ayarların tümü temsilcisi sonuçlar üretmek için kullanılan araç otomatik olarak ayarlanır.
- SNPs oluşturulan liste seçim tahlil tasarım aracı girin.
- Seçilen araç ve sipariş astar bir oligomer sağlayıcısından tasarım verilecek: 25 nmol her PCR astar (ileri ve geri) ve her birinin uzantısı astar 100 nmol. Temsil edici sonuçlar üretmek için kullanılan astar bkz. Tablo 1 .
2. Genotipleme (1-2 gün)
- Amplifikasyon astar hazırlayın.
- Liyofilize astar sipariş ettiyseniz, moleküler sınıf su ile yeniden oluşturma. 100 μm kalınlığında/μL bir konsantrasyon ileriye ve geriye doğru astar ve 500 mikron/μL uzantısı için kullanın.
- Havuzu astar her astar, 0,5 mM bir konsantrasyon içeren bir hisse senedi astar karışımı içine her çoğaltılmış tahlil için ileri ve geriye doğru.
Not: Örneğin, 400 reaksiyonlar için 400 μL astar havuzu:
100 μm kalınlığında/μL, konsantrasyon, her astar 2 μL hisse senedi astar havuzu için gereklidir. 60 ileriye ve geriye doğru astar ile 30-plex tahlil için astar 120 μL toplam olurdu (konsantre astar havuzu) gerekli. 280 μL moleküler düzeyde su sonra mix son hacmi 400 μL astar yapmak için eklenebilir.
- Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) kullanarak amplifikasyon
- 100 içeren PCR için ana bir karışım yapmak nM astar Mix detaylı dNTPs, 2 mM MgCl2500 mikron ve 0,5 U bir DNA polimeraz enziminin yukarıda. 1 U 26-plex deneyleri daha büyük için gereklidir. Tablo 2' ye bakın.
- Her şey 384-şey PCR plaka ile birlikte 5-10 ng/μL bir konsantrasyon, genomik DNA'ın 1 μL 4 μL bu karışımı ekleyin.
Not: kalite denetimleri de bir şablon denetim ve daha önce de tahlil ile (bir test çalışması sırasında) gerçekleştirmiş olan olumlu denetim gibi plaka üzerinde bulunmalıdır. Birden çok çalışan, diğer plate(s) Örneğinbirden fazla DNA örnekleri., nüsha arası plate değişkenliği için Teknik denetimleri olarak çalıştırmanız gerekir. - 200 x g tüm sıvı plaka kuyu alt kısmında yer alan sağlamak için bir plaka kapak ile Oda sıcaklığında 1 dk. için plaka santrifüj kapasitesi.
- PCR ile aşağıdaki thermocycler koşullar çalıştırın: 4 dk kuluçka 94 ° C'de DNA polimeraz; etkinleştirmek için Aşağıdaki 45 devir (20 94 ° C'de denatürasyon s, 30 s ve uzantısı için 1 dk 72 ° C'de 56 ° C'de tavlama) ve PCR programa Tablo 3' te 3 dk. öner için 72 ° C'de sonra son bir uzantısı.
- DNA amplifikasyon başarılı olduğundan emin olmak için özel jel elektroforez gerçekleştirin. 1 µL PCR ürününün (ile 3 µL yükleme arabelleği) özel toz ve % 0,5 Tris bor EDTA (TBE) tampon, karıştırılarak yapılan bir %2 (w/v) özel jel kullanın ve için 45 dk 100 V çalıştırın.
- Karides alkalen fosfataz (SAP) arıtma adım
Not: Bu adımı unincorporated nükleotit kaldırmak için kullanılır. SAP enzim aşırı astar ve adi dNTPs yaklaşan uzantısı tepki olarak engellemesini önlemek için fosfat grupları cleaves.- Bir master 1.7 birimleri/μL karides alkalin fosfataz (SAP) enzim, 10 x SAP arabellek içeren mix ve moleküler düzeyde su ile cilt için makyaj yapmak. Tablo 4' e bakın.
- 2 ekleyin μL kadar SAP taze yapılmış, her şey zaten PCR reaksiyon gelen 5 μL içeren plaka, karışıma usta. Kısaca santrifüj kapasitesi ve thermocycler 40 dk 37 ° C'de ve sonra 85 ° c enzim inactivation için 5 min için geri dönün. Tablo 5' e bakın.
- Astar uzantısı tepki
Not: Uzantısı astar uzantısı astar karışımında konsantrasyonu (Linear astar ayar-LPA) boyutuna göre ayarlanması gerekir. En yüksek yoğunluk (üzerinde kitle spectra) ve ürün ters bir ilişki olduğundan budur kitle. Uzantısı astar konsantrasyon düzeltilmesi eşit yoğunluklarda doruklarına üretmek bu ilişki için düzeltir. Tablo 6 & 7içinde sağlanan sonuçlar temsilcisi oluşturmak için kullanılan astar ayarlanabilir. 1.5 mL uzantısı astar karışımı oluşturmak için sağlanan birimleri vardır.- Seyreltme faktörler Agena Biosciences ('doğrusal astar ayarlaması'), kütle ve astar ve astar çoğaltılmış tepki (bkz: toplam sayısı konsantrasyon için ayarlar edinilebilir degrade bir algoritma kullanarak her astar için hesaplamak Tablo 6 & 7). UEP kitle için her astar Linear astar ayar sayfası UEP_MASS alanına girin.
Not: Astar için kitle ayarlanan konsantrasyonu hücre üstbilgi metni "Hedef tepki konsantrasyon (µM)" ile otomatik olarak hesaplanır Birimin astar astar havuzuna eklemek için üstbilgi metni "Havuzu (µL) eklenecek birim hisse senedi astar." altında hücredeki çıktısı Hesaplanan konsantrasyonları kadar yapmak için astar havuzu eklenecek su hacmi hücre metninin yanında "olmak PCR sınıf RNase free H2O hacmi astar Havuzu (µL) eklenir." çıktı - Birimin her astar belirtildiği gibi Linear astar ayar dosyasında götürüp bir astar Havuzu. 2.4.1. adımda belirlenen astar havuzu sulandırmak için algoritması tarafından hesaplanan su hacmi ekleyin.
Not: degrade algoritması Yöntem kullanılamıyorsa düşük kütle ve yüksek kitle astar bölmek ve çift konsantrasyonu yüksek kitle astar göreceli olarak düşük kitle grup eklemek için başka bir yöntem olur. Üç veya dört grup yüksek-plex tayini için gerekli olabilir (diğer bir deyişle, daha fazla 19 SNPs). Ancak, bu yöntem en iyi arama ücretleri degrade algoritması yöntemi olarak olarak vermez. - Uzantısı ana karışımı bir araya getirin. Düşük plex tahlil için (1-18 parça) arabelleği 0.2 μL, 0.1 μL fesih Mix, 0,94 μL ayarlanabilir LPA astar mix ve (buzda hazır) enzim 0.0205 μL ekleyin. Yüksek plex tahlil için (19-36 parça) fesih mix ve enzim (fesih mix 0,2 μL ve iPLEX enzim 0.041 μL) Çift Kişilik konsantrasyon ekleyin. Tablo 8' e bakın.
- Uzantısı tepki ana Mix 2 μL plakasına toplam hacim 9 μL iyi ücret için konuşmanın önceki tepki ekleyin. Kısaca santrifüj kapasitesi ve yer içinde thermocycler: 94 ° C için bir 30 s ilk kuluçka, 1 x 94 ° C 40 döngüleri için 5 s ile 5 x (52 ° C 5 için 80 ° C 5 ardından s, s) ve sonra 72 ° C 3 dk. Tablo 9bakın.
- Seyreltme faktörler Agena Biosciences ('doğrusal astar ayarlaması'), kütle ve astar ve astar çoğaltılmış tepki (bkz: toplam sayısı konsantrasyon için ayarlar edinilebilir degrade bir algoritma kullanarak her astar için hesaplamak Tablo 6 & 7). UEP kitle için her astar Linear astar ayar sayfası UEP_MASS alanına girin.
- Arıtma reçine.
Not: Aşırı tuzları artık reçine ile belgili tanımlık kullanma tepkiden kaldırılabilir.- 16 μL deiyonize su kuyuları tarihinde erişilmiştir plaka, plaka 25 μL kadar ses getiren ekleyin.
- Reçine, genellikle 6 mg (ayrı olarak satın), Gamze Reçine plaka bütün tabağı için eşit olarak uygulanır. Reçine çukur tabak, oda sıcaklığında 20 dakika içinde tepki plakasına uygulamadan önce kuru reçine bırakın. Reçine eklenmesinden sonra plaka oda sıcaklığında 5 min için el ile veya yavaş hızda bir süspansiyon karıştırıcılı döndürme (Örn., 7.5 devir/dakika).
Not: Genotipleme analit Genotipleme çip üzerine önce yükleme, örnekleri ve tahlil düzeni yazılım arayüzü içine giriş gerekir. Bu tahlil tasarım aracı tasarım Özeti dosyasını kullanarak elde edilebilir.
- Ölçüm bir kütle spektrometresi platformda.
- 3200 x g reçine uygulama kitle spectra çip önlemek 5 min için plaka santrifüj kapasitesi.
- Plaka düzeni örneklerinin sistemin yazılım arayüzü koşmak önce yükleyin.
Not: Adım 2.6.3 yalnızca eğitimli personel tarafından gerçekleştirilmelidir. - Genotipleme analit karışımı plaka Genotipleme çip ile bir dağıtım sistemi uygulanır. Ardından, çip kitle spectra sonra platformu yazılım arabirimi yardımıyla yorumlanabilir analit karışım oluşturmak için MALDI-TOF sisteminize yükleyin.
Not: Sistem kitle spectra 'kitle spectra çipin Genotipleme plaka tek bir şey için karşılık gelen her pad,', UV ışığı kısa darbeleri yönlendirerek oluşturur. Bu darbe desorpsiyon ve analit iyonlaşma ile sonuçlanır. Bunlar DNA iyonize moleküller o zaman tahrikli vakum tüplü tepesine daha hızlı seyahat ve dedektör, ilk olarak, ağır iyonları ulaşmak daha hafif iyonları, dışarı ayıran bir yüksek gerilim elektrostatik alana göre. "Zaman uçuş" Bu analitler hangi kitle her DNA parçasının belirlenebilir ve böylece nükleotid baz SNP mevcut anlaşılmaktadır olabilir sistem tarafından kaydedilir.
3. Genotipleme veri
Not: kalite kontrol ve veri yorumu Bu metodoloji kağıt odak değildir. Ancak, aşağıda kısaca kitle spectra yorumu kapsar.
- El ile denetim ve kalite kontrol kitle spectra ürününün.
Not: Ham yığın spectra sistemi tarafından oluşturulan ve Malzemeleri tablodalistelendiği gibi yazılım ile analiz. Bir Gauss karışım Yöntem kümeleme probabilistic Genotipleme arama yapmak için bu çıkış için uygulanır.- Analiz yazılımı açın. Typer Analyzerseçin. Dosya menüsünden Dosya açık kuyulardan seçin ve 2.6.3 adımda oluşturulan spektrum verileri içeren xml dosyası seçin. Yonga adı Çalıştır görünür olmalıdır için seçin ve 384-şey plaka "trafik ışığı" bölme-ecek var olmak göstermek SNPs seçili bir listesini de. Buradan, scatterplot veri noktalarının her SNP için görüntülemek için Ara arsalar küme seçin.
Not: Bu bir 'arama' sonuç düşük yoğunluklu SNPs uygulanması tavsiye edilir. Temsil edici sonuçlar için kullanılan yazılım, varsayılandan daha yüksek olan bir küme büyüklüğü cut-off 5, sıkı kalite kontrol için önerilmektedir. Bu ayar parametreleri altındaki büyüklüğü kesim alanı Posta işleme kümeleri bölmesinde ayarlanabilir. Autocluster bir küme Analizi çalıştırmak için Araçlar sekmesinden seçin. - Kartezyen arsalar sonrası işleme bölmesinde inceleyerek genotip aramaların manuel olarak kontrol edin. Tahlil bölmesinde SNP faiz ve Post-Processing kümeleri sekmesini tıklatın seçin, bir küme komplo kümeleme genotip ile örnek kimlikleri ve karşılık gelen genotip SNP için görünür olacak.
- Genotip çağrı kümeleri incelemek ve değerlendirmek ne kadar iyi bireysel her çağrı ile diğer aramalar için SNP kümeleri. Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı için her genotip rehberlik için arsa üzerinde bazı sınır çizgileri sağlar; bir IL13 SNP (Şekil 1) gelen bir genotip çağrıları küme Arsa örnek bakın. Çağrı sıkıca diğer aramalar ile küme değil ve açıkça bir küme dışında oturur veya çok düşük yoğunluklu varsa, doğru tıkırtı datapoint ve el ile Hayır aramakayarlamak için Değişiklik ara seçin.
- Aşağı akım analiz için kullanılan yüksek kaliteli Genotipleme veri sağlamak için SNPs ve arama ücretleri bir QC eşiğin, Örneğin % 90 olan kişiler hariç. Arama veri için uygun ayarlamalar yapıldıktan sonra istatistik uygulamaları için veri verin. ( Tablo reçetesilistelenen) temsilcisi sonuçlar üretmek için kullanılan yazılım bu görünüm menüsünü ve Kaydet'iseçerek Plaka veri seçimden ile elde edilir.
- Analiz yazılımı açın. Typer Analyzerseçin. Dosya menüsünden Dosya açık kuyulardan seçin ve 2.6.3 adımda oluşturulan spektrum verileri içeren xml dosyası seçin. Yonga adı Çalıştır görünür olmalıdır için seçin ve 384-şey plaka "trafik ışığı" bölme-ecek var olmak göstermek SNPs seçili bir listesini de. Buradan, scatterplot veri noktalarının her SNP için görüntülemek için Ara arsalar küme seçin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda açıklanan protokol ile biz genotyped bir kohort gıda alerji durumları ve denetimleri9Th2 bağışıklık gen IL13 genelinde SNPs etiketleyin. Biz logistic regresyon analizi, ilgi bölgedeki genetik varyantların gıda alerji riski artmış olup olmadığını sınamak soy ve diğer potansiyel covariates için uygulanır. Tablo 10 9 bir varyant rs1295686 meydan kanıtlanmış yiyecek alerji ile ilişkili ve bu ilişki kullanarak bir çoğaltma kohort Genotipleme yaklaşım multiplexed doğruladı gösterir. İki tabur sonuçlarından bir meta-analizi IL13 Derneği SK (Tablo 11)9ile güçlü kanıtlar sağlanan. Genetik olarak anlaşılmaktadır ve soyundan yayımlanmış paneli10uyarlanmış bir soy bilgilendirici SNP marker, masası analiz için ayarlanır. Biz genotyped istimal ayni paneli multiplexed yaklaşım tahlil.
İlişkili değişken, rs1295686, daha önce bir astım riski loci11 tanımlanan ve genel alerjik hastalık riski loci olabilir düşündüren diğer alerjik immünolojik parametreleri12ile ilişkili. Sonraki adımlar olacağını fark ifade analizi, kromatin yakalama yöntemi ile fiziksel etkileşimleri eşleme gibi daha fazla çalışmalar yapmak, eşleme bölgenin güzel ve yıkmaya haplogrubundan analiz, fonksiyonel varyantı üzerine gelin ve karakterize Biyoloji gözlenen derneğin gıda alerjisi arkasında.
Şekil 1: Kartezyen küme arsa için IL13 SNP rs1295686. Sarı kümeleri için A gen, G alleli için mavi ve yeşil Heterozigoz aramalar için homozigoz genotip çağrılarını temsil eden. Değil küme kaç genotip telefon ya da homozigoz veya Heterozigoz kitle spectra ile "hiçbir çağrısına." kuruldu
Tablo 1: IL13için temsil edici sonuçlar üretmek için kullanılan astar dizileri. Adı sütununda SNP kimliği, iyi numarası bulunur (daha önce belirtildiği gibi "iyi" kaç çoğaltılmış tahlil Kımlığı gösterir) ve astar (ileri için F, reverse için R ve uzantısı astar için UEP) türü. Sonraki sütun astar dizisi, astar ve arıtma tipi boyutunu içerir. Bu SPINK5 ve bir soy bilgilendirici işaretleri (AIM) panel bu sonuçlar ile sunulan temsilcisi sonuçları tartışılmamış rağmen aynı tahlil kullanarak genotyped olması gerekmektedir. _CEU ve _CHB biten SNPs amaç SNPs Kuzey Avrupalılar için Utah ve Han Çince 1000 genom projesi Beijin, Çin nüfus olarak sırasıyla bakın. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
| Master Mix | Düşük Plex (≤26 SNPs) | Yüksek Plex (> 26 SNP) | |||
| Reaktif | 5 µL konsantrasyonlu | × 1 | × 200 | × 1 | × 200 |
| Su (deiyonize) | 1.9 | 380 | 1.8 | 360 | |
| Arabellek | 1 × (2 mM MgCl2) | 0,5 | 100 | 0,5 | 100 |
| MgCl2 | 2 mM | 0,4 | 80 | 0,4 | 80 |
| dNTPs | 500 MİKRON | 0,1 | 20 | 0,1 | 20 |
| Astar mix ** | 100 nM | 1 | 200 ** | 1 | 200 ** |
| Taq polimeraz | 0,5 U / 1 U | 0,1 | 20 | 0,2 | 40 |
| Toplam | 4 ΜL | 800 ΜL | 4 ΜL | 800 ΜL | |
| ** zaten deiyonize H20 ayrıntılı olarak 2.1.2 ile seyreltilmiş | |||||
Tablo 2: mix amplifikasyon PCR astar yapmak için gereken konsantrasyonları ve reaktifler. Ana mix birimleri için 200 reaksiyonlar 400 (384-şey plaka karşılamak için yeterli) 1,5 µL tüp içine sığmaz ve böylece 2 x 200 ayrı tüplerde yapılmalıdır çünkü verilir. Çoğaltılmış tahlil "iyi" 26 SNPs, eşit veya daha büyük, daha 26 SNPs iyi kullanımda yüksek Plex birimleri içerir düşük Plex altında belirtilen birimlerden kullanılmalıdır.
| Thermocycler koşulları |
| 4 dk için 94 ° C |
| 45 devir (94 ° C 20 s, 56 ° C 30 s, 72 ° C 1 dk) |
| 3 dk 72 ° C |
| 4 ° C tutun |
Tablo 3: Thermocycler koşulları amplifikasyon PCR.
| Master Mix | × 1 | × 410 |
| Su (deiyonize) | 1.53 | 627.3 |
| 10 × arabellek | 0.17 | 69.7 |
| SAP enzim (1.7 U/µL) | 0,3 | 123 |
| Toplam | 2 ΜL | 820 ΜL |
Tablo 4: reaktifler ve konsantrasyonları SAP tepki için ana karışımı için. Ana mix birimleri 384-şey plaka pipetting hata payımız ile karşılamak 410 reaksiyonlar için verilir.
| Thermocycler koşulları |
| 40 dk. 37 ° C |
| 5 min için 85 ° C |
| 4 ° C tutun |
Tablo 5: SAP reaksiyon için gerekli Thermocycler koşulları.
| # | Uzantısı astar | Özgün hisse senedi toplama (µM) | Sair giderler | UEP_ KİTLE | Hedef tepki konsantrasyonu (µM) | EXT astar havuzu konsantrasyonu (µM) | Havuzu (µL) eklenecek birim hisse senedi astar |
| 1 | rs36110_CHB | 500 | 4359.8 | 0.560 | 5.36 | 16.09 | |
| 2 | rs10488619_CHB | 500 | 4546 | 0.602 | 5.76 | 17.29 | |
| 3 | rs1986420_CEU | 500 | 4761.1 | 0.648 | 6,21 | 18.62 | |
| 4 | rs2934193_CEU | 500 | 4964.3 | 0.690 | 6.61 | 19.82 | |
| 5 | rs4968382_CEU | 500 | 5047.3 | 0.707 | 6.77 | 20.30 | |
| 6 | rs1227647_CEU | 500 | 5136.4 | 0.724 | 6,93 | 20,80 | |
| 7 | rs1402851_CEU | 500 | 5338.5 | 0.763 | 7,30 | 21.91 | |
| 8 | rs4705054 | 500 | 5476.6 | 0.788 | 7,55 | 22.64 | |
| 9 | rs6928827 | 500 | 5678.7 | 0.824 | 7.89 | 23,68 | |
| 10 | rs9325072 | 500 | 5762.8 | 0.839 | 8,03 | 24,10 | |
| 11 | rs4841401_CHB | 500 | 5853.9 | 0.855 | 8,18 | 24.55 | |
| 12 | rs11098964_CHB | 500 | 6052.9 | 0.888 | 8,50 | 25.51 | |
| 13 | rs2416504_CHB | 500 | 6174 | 0.908 | 8,69 | 26.08 | |
| 14 | rs1860933 | 500 | 6264.1 | 0.923 | 8.83 | 26,50 | |
| 15 | rs2193595_CHB | 500 | 6391.2 | 0.943 | 9,03 | 27.08 | |
| 16 | rs1519260_CHB | 500 | 6469.2 | 0.955 | 9.14 | 27.43 | |
| 17 | rs11184898_CHB | 500 | 6588.3 | 0.973 | 9,32 | 27,95 | |
| 18 | rs679832_CEU | 500 | 6757.4 | 0.998 | 9,56 | 28.68 | |
| 19 | rs326626_CEU | 500 | 6765.4 | 1.000 | 9,57 | 28.71 | |
| 20 | rs1612904 | 500 | 6873.5 | 1.015 | 9,72 | 29.17 | |
| 21 | rs862942 | 500 | 6960.5 | 1.028 | 9,84 | 29.53 | |
| 22 | rs2486448_CHB | 500 | 7169.7 | 1.058 | 10,13 | 30.38 | |
| 23 | rs4824001_CEU | 500 | 7341.8 | 1.081 | 10,35 | 31.06 | |
| 24 | rs6552216_CEU | 500 | 7465.9 | 1.098 | 10,51 | 31.54 | |
| 25 | rs1488299_CHB | 500 | 7620 | 1.119 | 10.71 | 32.13 | |
| 26 | rs1347201_CHB | 500 | 7626 | 1.119 | 10.72 | 32.15 | |
| 27 | rs315280_CHB | 500 | 7747 | 1.135 | 10,87 | 32.60 | |
| 28 | rs11203006_CHB | 500 | 7834.1 | 1.146 | 10.97 | 32.92 | |
| 29 | rs4240793_CHB | 500 | 8036.3 | 1.172 | 11.22 | 33.66 | |
| 30 | rs9325071 | 500 | 8219.4 | 1,194 | 11.43 | 34.30 | |
| 31 | rs12678324_CEU | 500 | 8394.5 | 1.215 | 11.64 | 34.91 | |
| 32 | rs4653130_CEU | 500 | 8455.5 | 1.223 | 11.71 | 35.12 | |
| 33 | rs9275596 | 500 | 8537.6 | 1.232 | 11,80 | 35.39 | |
| 34 | rs12595448_CHB | 500 | 8603.6 | 1.240 | 11,87 | 35.62 | |
| Olmak PCR sınıf Rnase free H2O hacmi astar Havuzu (µL) eklendi | 561.78 | ||||||
Tablo 6: temsilcisi sonuçlar üretmek için kullanılan de 1 ayarlanan astar. Hedef toplama, astar havuzu ve nihai toplama iyi 1 için astar havuzundaki her astar için kullanılan birim de dahil olmak üzere boyutuyla ayarlanmış uzantısı astar tablosu. Son hacim telafi etmek için gereken su hacmi tablonun altındaki sağlanır. Astar havuzun hacmi 1.5 mL yapıldı.
| # | Uzantısı astar | Özgün hisse senedi toplama (µM) | Sair giderler | UEP_ KİTLE | Hedef tepki konsantrasyonu (µM) | EXT astar havuzu konsantrasyonu (µM) | Havuzu (µL) eklenecek birim hisse senedi astar |
| 1 | rs10515597 | 500 | 4482.9 | 0.588 | 5,63 | 16.89 | |
| 2 | rs2759281_CEU | 500 | 4921.2 | 0,681 | 6.52 | 19.57 | |
| 3 | rs17641748 | 500 | 5080.3 | 0.713 | 6.83 | 20.48 | |
| 4 | rs1698042_CEU | 500 | 5201.4 | 0.737 | 7.05 | 21.16 | |
| 5 | rs5753625_CHB | 500 | 5411.6 | 0.776 | 7.43 | 22,30 | |
| 6 | rs3912537_CEU | 500 | 5811.8 | 0.848 | 8.12 | 24.35 | |
| 7 | rs6141319_CEU | 500 | 5883.8 | 0.860 | 8.23 | 24,70 | |
| 8 | rs1002587_CEU | 500 | 6026.9 | 0.884 | 8.46 | 25.39 | |
| 9 | rs1295686 | 500 | 6172 | 0.908 | 8,69 | 26.07 | |
| 10 | rs16877243_CEU | 500 | 6386.2 | 0.942 | 9,02 | 27.05 | |
| 11 | rs1103811 | 500 | 6595.3 | 0.974 | 9.33 | 27.98 | |
| 12 | rs6510332_CEU | 500 | 6790.4 | 1.003 | 9.61 | 28.82 | |
| 13 | rs6595142_CHB | 500 | 6874.5 | 1,016 | 9,72 | 29.17 | |
| 14 | rs4484738_CEU | 500 | 6966.5 | 1.029 | 9,85 | 29,55 | |
| 15 | rs1432975 | 500 | 7028.6 | 1.038 | 9.94 | 29.81 | |
| 16 | rs10879311_CEU | 500 | 7317.8 | 1.078 | 10.32 | 30.97 | |
| 17 | rs864481 | 500 | 7416.9 | 1.092 | 10.45 | 31.35 | |
| 18 | rs1295687 | 500 | 7447.8 | 1.096 | 10.49 | 31,47 | |
| 19 | rs12644851_CHB | 500 | 7634 | 1.120 | 10.73 | 32.18 | |
| 20 | rs4265409_CHB | 500 | 7926.2 | 1.158 | 11.09 | 33.26 | |
| 21 | rs2927385_CHB | 500 | 7997.2 | 1.167 | 11,17 | 33.52 | |
| 22 | rs1538956_CHB | 500 | 8286.4 | 1.202 | 11.51 | 34.54 | |
| Olmak PCR sınıf Rnase free H2O hacmi astar Havuzu (µL) eklendi | 899.42 | ||||||
Tablo 7: temsilcisi sonuçlar üretmek için kullanılan de 2 ayarlanan astar. Hedef toplama, astar havuzu ve nihai toplama iyi 2 için astar havuzundaki her astar için kullanılan birim de dahil olmak üzere boyutuyla ayarlanmış uzantısı astar tablosu. Son hacim telafi etmek için gereken su hacmi tablonun altındaki sağlanır. Astar havuzun hacmi 1.5 mL yapıldı.
| Master Mix | Düşük Plex (1-18) | Yüksek Plex (19-36) | ||
| Reaktif | × 1 | × 410 | × 1 | × 410 |
| Su (deiyonize) | 0.7395 | 303.195 | 0.619 | 253.79 |
| Arabellek | 0,2 | 82 | 0,2 | 82 |
| Fesih mix | 0,1 | 41 | 0,2 | 82 |
| Astar mix (LPA ayarlanabilir) | 0,94 | 385.4 | 0,94 | 385.4 |
| iPLEX enzim * | 0.0205 | 8.405 | 0.041 | 16.81 |
| Toplam | 2 ΜL | 820 ΜL | 2 ΜL | 820 ΜL |
Tablo 8: reaktifler ve konsantrasyonları uzantısı reaksiyon için master mix. Bu durumda kuyuda 18 veya daha az SNPs varsa bu birim düşük-Plex reaksiyonlar için kullanılmalıdır. 19 veya daha fazla SNPs için yüksek Plex reaksiyonlar birimler kullanın. Bu yüksek-plex Tablo 2' de ayrıntılı amplifikasyon PCR ana mix ve düşük-plex SNP gereksinimleri farklıdır.
| Thermocycler koşulları |
| 94 ° C 30 s |
| 40 döngüleri (94 ° C 5 s, (52 ° C 5 s, 80 ° C 5 s 5 döngüleri)) |
| 3 dk 72 ° C |
| 4 ° C tutun |
Tablo 9: Thermocycler koşulları uzantısı tepki için
| Gıda alerjisi vs gıda dışı Alerjik denetimleri durumlarda | |||||
| SNP | A1 | P | OR | L95 | U95 |
| rs1295686 | A | 0,003 | 1.75 | 1.2 | 2.53 |
| rs2243297 | A | 0,13 | 2.1 | 0.8 | 5,51 |
| rs1295687 | G | 0,19 | 1,63 | 0.78 | 3.41 |
| rs2243211 | A | 0,22 | 1,45 | 0.8 | 2.64 |
| rs1295683 | T | 0,25 | 1,32 | 0.82 | 2,13 |
| rs2243248 | G | 0.51 | 1.21 | 0,69 | 2.11 |
| rs2243300 | T | 0.51 | 1.19 | 0,7 | 2,02 |
| rs1800925 | T | 0,6 | 1.11 | 0,75 | 1,63 |
| rs3091307 | G | 0.62 | 1.1 | 0,75 | 1.6 |
Tablo 10: Değişken rs1295686, IL13 odağı meydan kanıtlanmış yiyecek alerji ile ilişkili. Logistic regresyon analizi, soyu, seks ve Atopik Egzama, varlığı için ayarlanmış ortaya bu varyant rs1295686 ilişkili besin allerjisi keşif kohort kanıtlanmış mücadele ile (n = 367 durumlarda ve 156 Allerjik olmayan denetimleri). Muayene ediliyor işaretleri SNP sütun listeler, A1 sütunu başvuru alleli Derneği test için kullanılan küçük alleli listeler. P sütun regresyon çözümlemesi P değerleri listeler, OR sütun karşılık gelen odds oranları listeler ve L95 ve U95% 95 güven aralığı çözümlemesi alt ve üst sınırları vardır. Veri Ashely et al., 20179çoğaltılamaz.
| A. çoğaltma Analizi: yiyecek Alerjik durumlarda vs gıda dışı Alerjik denetimleri | B. Meta-analiz-bulma ve çoğaltma | ||||||||||
| SNP | A1 | OR | L95 | U95 | P | P | P(R) | OR | OR(R) | Q | Ben |
| rs1295686 | A | 1.37 | 1.03 | 1,82 | 0.03 | 0.0005 | 0,0006 | 1.5 | 1.5 | 0.31 | 3.32 |
| rs1295687 | C | 1.1 | 0,68 | 1,78 | 0,7 | 0,3 | 0,3 | 1,24 | 1,24 | 0.38 | 0 |
Tablo 11: Çoğaltma bağımsız bir nüfus arasındaki ilişkiyi onaylar IL13 değişken rs1295686 ve meydan okuma kanıtlanmış besin allerjisi. Logistic regresyon, soy asıl bileşenleri, seks ve Atopik Egzama, bağımsız bir popülasyon için düzeltilmiş (n = 203 yiyecek Alerjik durumlarda ve 330 Allerjik olmayan denetimleri) varyant rs1295686 ve gıda alerji arasındaki ilişkiyi doğruladı. Meta-analiz sonra kanıt SNP ve sonuç arasındaki ilişki için en üst düzeyde sağlayan yapılmıştır, heterojenlik az kanıt ile etkin bu SNP adlı iki popülasyonun arasında boyutlandırır. Burada Tablo 10, ek P(R) ile başı olarak sütun biçimidir ve OR(R) değerleri rastgele etkileri meta-analizi için model vs sabit etkileri modeli (P ve veya). Q ve P-değeri Cochrane test ve ben-dizin için sırasıyla, her ikisi de çalışmalar arasında etkisi boyutlarda heterojenite önlemler vardır. Veri Ashely et al., 20179çoğaltılamaz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, kütle spektrometresi kullanılarak çoğaltılmış Genotipleme yöntemi göstermektedir. Temsilcisi sonuçları PCR MALDI-TOF Kütle spektrometresi4 tahlil kimya ile Malzemeler tablo13' te listelenen ile eşleştirilmiş kullanarak oluşturulan. Bu platformla Laboratuarı ' 1,255 bireyler için 40 h içinde 9 SNPs üzerinde 11,295 genotip toplam oluşturulan.
Biz genetik hipotezler üretme ve bir keşif klinik kohort phenotyped besin allerjisi için ve bağımsız çoğaltma ile aday gen IL13 SNP veri çözümleme tarafından cevap tekniği kullanışlılığı göstermektedir. Platform DNA kalite alt nispeten sağlam ve en az Başlangıç materyali, sadece 10 giriş gerektirir ng. İletişim kuralı kritik adımlar aşağıdakileri içerir: maksimal SNP eklenmesi çoğaltılmış deneyleri başarılı amplifikasyon hedef bölgeleri amplifikasyon PCR, başarılı tek sırasında emin olmak için tahlil tasarım sürecinin dikkatli sorun giderme nükleotit uzantısı uzantısı tepki ve doğru bir şekilde kitle spectra veri atamak yazılımınızın analiz yazılımı içine tahlil ve örnek plaka düzeninin yükleme sırasında.
Daha önce belirtildiği gibi tahlil tasarım aracı Ayrıca insan için fare ve sığır polimorfizmleri kullanımı ile uyumludur. Mikrop veya bitki gibi diğer organizmalar için "diğer" "Organizma" menüde seçilebilir. Ancak, en iyi astar alanları tespit proksimal SNPs bulma ve otomatik adımları kullanılamaz.
Tasarım işlemi sırasında proksimal SNP bir en uygun astar alanı tanımlaması engelliyorsa bir ya SNP tasarımından kaldırmak ve başka bir yüksek LD seçin (Örneğin, r2 = 1), veya iki astar, bir başvuru ile tasarlamak seçin alleli SNP ve bir alternatif alleli, ya da bir astar ile ortak alleli tasarlama veya (Örneğin, inosin) evrensel bir tabanı ile SNP maskeleme ile. Astar için benzersiz bir siteyi bir sorun varsa, benzersiz bir site bulmak için amplicon uzunluk ayarı değiştirebilirsiniz. 80-120 bp varsayılan ayardır ancak bu 60-400 bp değiştirilebilir. Ancak, Eğer bozulmuş DNA (Örneğin, FFPE dokusundan) ile çalışma, bu amplicon uzunluğunu artırmak ideal değildir unutulmamalıdır.
Aracın tahlil Tasarım aşaması sırasında hataları yüksek saç tokası veya astar dimer potansiyel içerebilir. Her iki ayar bir accommodate tasarımları deneyin için rahat. Ancak, bu eşikleri 0,8 rahat değil tavsiye edilir; Bu ayar SNPs kurtarma ve 0,8 yalnızca gerekirse azaltmak için yeterli olup olmadığını görmek için 0,9 ile başlayın. Gelişmiş ayarlarda (en çok 10) tasarım yineleme sayısını "4. Multiplex sekmesi altında değiştirmek mümkündür Deneyleri "tasarım", aynı zamanda en iyi yineleme seçim ölçütlerini En yüksek ortalama Multiplex veya Düşük Plex tarafından en az sayıda reddeder. Aracın ilk SNP sırayla verilmiştir ve bir tahlil tasarlayacak alacak çünkü tasarım yineleme sayısını artırarak avantajlı olabilir. Daha sonra sonraki SNP aynı multiplex tahlil için uyumlu olup olmadığını sınar. Böylece, sipariş SNPs maddenin. Seçili birden çok yineleme seçeneği ile yazılım SNPs sırasını rastgele ve diğer yinelemeleri deneyin. Bu SNPs her multiplex tasarlanmış olması mümkün sayısını artırabilir veya SNP reddeder sayısını azaltabilir. Tasarım aracı bu adımda çok daha uzun sürer gibi ancak, ayrıca bir kez ücret karşılığında gelecek.
Çoğaltılmış Genotipleme loci ilgi incelenmesi için hızlı ve uygun fiyatlı bir yaklaşımdır. Yöntem kesintisiz hale getirilir ve on binlerce bir gün14az oluşturulacak genotip izin çalışan 40-plex SNPs kadar yaklaşık 760 örnekleri 10 saat sağlar. Kitle spectra platform tarafından sağlanan araçlar ile kolayca çözümlenebilir.
Bazı kısıtlamalar platformu için tahlil tasarım işleminin başarısız olur SNPs % 5-10 tahmini bir kaybı vardır. Bu bazen bir alternatif etiketinin veya proxy SNP seçime göre düzeltilebilir. Broad Enstitüsü nün SNP ek açıklama ve Proxy arama (ek) veritabanı proxy SNPs15tanımlaması kolaylaştıran böyle bir araçtır. Başka bir sistem hedeflenen bir platformu ve bu nedenle geniş roman keşif için izin vermez genom çapında yaklaşımlar ile elde kısıtlamasıdır. Yaklaşım kapsama genler arasında en üst düzeye çıkarmak için etiket-SNP proxy'lerini kullanır gibi Ayrıca, fine-haritalama çalışmaları daha sonra kesin nedensel değişken belirlemek için gerekli olabilir.
Çoğaltılmış Genotipleme hala GWA çalışma yaklaşımlar veya aday ve yol gen keşif tahrik hipotez tanımlanan ilişkili hastalık SNPs sorgulama için yararlı bir platformdur. Gelecekteki uygulamalar platformu için roman kullanımları teşhis ve tarama kanser ve klinik Viroloji gibi alanlarda olması muhtemeldir. Genel olarak çoğaltılmış Genotipleme kütle spektrometresi ile bir hızlı, uygun maliyetli ve güvenilir orta-den geçerek için Genotipleme aday loci yöntemidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar hiçbir katkıda bulunanlar var.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Genomic DNA | - | - | 1 μL at a concentration of 5-10 ng/μL |
| Primers: forward and reverse amplification and extension | IDT | - | see manuscript section 1.2.1 on design of primers |
| Deionized water | E.g. Milli-Q water | - | deionized with 18.2 MΩ.cm resistivity |
| Genotyping reagent kit. iPLEX Gold Chemistry reagent set | Agena Bioscience | #10148-2 | includes all reagents for reactions in 2.2.1, 2.3.1 and 2.4.2 , chip and resin |
| PCR plates (384-well) | Abgene | #ABGAB-1384 | For the MassARRAY system plates by Abgene are compatible |
| Micropipettes | single and 8-channel | ||
| Centrifuge | compatible with 384-well plates | ||
| Thermocycler | compatible with PCR programs as detailed in 2.2.4, 2.3.2 and 2.4.3 | ||
| Dimple resin plate | Agena Bioscience | 6mg, 384-well | |
| Plate rotator | |||
| MassARRAY Analyzer 4 System | Agena Biosciences | MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight) Mass Spectrometer. | |
| RS1000 Nanodispenser | Agena Biosciences | ||
| Assay Design Suite | Agena Biosciences | Tool used to design the multiplex genotyping assays | |
| Hot Start Taq | DNA polymerase enzyme | ||
| Resin | Agena Biosciences | Supplied with iPLEX kit |
References
- Aronson, S. J., Rehm, H. L. Building the foundation for genomics in precision medicine. Nature. 526 (7573), 336-342 (2015).
- Ball, R. D. Designing a GWAS: power, sample size, and data structure. Genome-Wide Association Studies and Genomic Prediction. , 37-98 (2013).
- Kwon, J. M., Goate, A. M.
- Oeth, P., Mistro, G. D., Marnellos, G., Shi, T., van den Boom, D. Qualitative and quantitative genotyping using single base primer extension coupled with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MassARRAY). Single Nucleotide Polymorphisms: Methods and Protocols. , 307-343 (2009).
- Pusch, W., Kostrzewa, M. Application of MALDI-TOF mass spectrometry in screening and diagnostic research. Current pharmaceutical design. 11 (20), 2577-2591 (2005).
- Su, K. Y., et al. Pretreatment epidermal growth factor receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer. Journal of clinical oncology. 30 (4), 433-440 (2012).
- Singhal, N., Kumar, M., Kanaujia, P. K., Virdi, J. S. MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis. Frontiers in microbiology. 6, 791 (2015).
- Cricca, M., et al. High-throughput genotyping of high-risk Human Papillomavirus by MALDI-TOF Mass Spectrometry-based method. New Microbiologica. 38 (2), 211-223 (2015).
- Ashley, S., et al. Genetic Variation at the Th2 Immune Gene IL13 is Associated with IgE-mediated Paediatric Food Allergy. Clinical & Experimental Allergy. 47 (8), 1032-1037 (2017).
- Bousman, C. A., et al. Effects of NRG1 and DAOA genetic variation on transition to psychosis in individuals at ultra-high risk for psychosis. Translational psychiatry. 3 (4), e251 (2013).
- Moffatt, M. F., et al. A large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma. New England Journal of Medicine. 363 (13), 1211-1221 (2010).
- Granada, M., et al. A genome-wide association study of plasma total IgE concentrations in the Framingham Heart Study. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3), 840-845 (2012).
- Oeth, P., et al. iPLEX assay: Increased plexing efficiency and flexibility for MassARRAY system through single base primer extension with mass-modified terminators. Sequenom application note. 27, (2005).
- Ellis, J. A., Ong, B. The MassARRAY System for Targeted SNP Genotyping. Genotyping: Methods and Protocols. , 77-94 (2017).
- Johnson, A. D., et al. SNAP: A web-based tool for identification and annotation of proxy SNPs using HapMap. Bioinformatics. 24 (24), 2938-2939 (2008).
