एक इन विट्रो मॉडल के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए 5-Aminolevulinic एसिड मध्यस्थता Photodynamic थेरेपी पर Staphylococcus aureus
Summary
इस पांडुलिपि एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए एक Staphylococcus aureus फिल्म पर 5-aminolevulinic एसिड की मध्यस्थता photodynamic थेरेपी (ाला-pst) के रोगाणुरोधी प्रभाव का अध्ययन. यह प्रोटोकॉल भविष्य में pst के साथ बैक्टीरियल फिल्म के उपचार का अध्ययन करने के लिए एक इन विट्रो मॉडल को विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Abstract
Staphylococcus aureus (एस aureus) एक आम मानव रोगज़नक़, जो pyogenic और प्रणालीगत संक्रमण का कारण बनता है । एस aureus संक्रमण एंटीबायोटिक प्रतिरोधी उपभेदों के उद्भव के कारण न केवल उंमूलन करने के लिए मुश्किल है लेकिन यह भी अपने को बनाने की क्षमता है । हाल ही में, photodynamic थेरेपी (pst) में एक संभावित उपचार के रूप में दर्शाया गया है कि फिल्म संक्रमण को नियंत्रित करने के लिए । हालांकि, आगे के अध्ययनों में बैक्टीरियल फिल्म पर इसके प्रभाव के बारे में हमारे ज्ञान में सुधार करने के लिए आवश्यक हैं, साथ ही अंतर्निहित तंत्र । इस पांडुलिपि 5-aminolevulinic एसिड (5-ाला), वास्तविक photosensitizer, protoporphyrin नौवीं (PpIX) के एक अग्रदूत साबित के साथ pst के इन विट्रो मॉडल में वर्णन करता है । संक्षेप में, परिपक्व एस aureus फिल्म अला के साथ मशीन और फिर प्रकाश को उजागर किया गया । इसके बाद, अला के जीवाणुरोधी प्रभाव-pst एस aureus पर फिल्म की गणना द्वारा quantified था कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFUs) और व्यवहार्यता के द्वारा visualized फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (CLSM) के माध्यम से धुंधला । प्रतिनिधि परिणाम एस aureus फिल्म पर अला-pst की एक मजबूत जीवाणुरोधी प्रभाव का प्रदर्शन किया । इस प्रोटोकॉल सरल है और एक इन विट्रो मॉडल को विकसित करने के लिए ाला-pst के साथ एस aureus के उपचार का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । भविष्य में, यह भी pst ंयूनतम समायोजन के साथ विभिंन जीवाणु उपभेदों के लिए अंय photosensitizers का उपयोग अध्ययन में संदर्भित किया जा सकता है ।
Introduction
एस aureus एक महत्वपूर्ण ग्राम-सकारात्मक रोगज़नक़ है कि मानव मेजबान की त्वचा और म्यूकोसा उपनिवेश करता है । इसकी क्षमता के रूप में फिल्म बनाने के लिए अपनी रोगजनन1का एक महत्वपूर्ण पहलू माना जाता है । बैक्टीरियल फिल्म एक स्वयं में एंबेडेड बैक्टीरिया का एक समुदाय है मैट्रिक्स का उत्पादन किया है, जो extracellular बहुलक पदार्थों से बना है, polysaccharide, डीएनए सहित, और प्रोटीन । इस मैट्रिक्स जीवाणु संक्रमण के हठ में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, मानव प्रतिरक्षा प्रणाली और वर्तमान विरोधी माइक्रोबियल चिकित्सा के लिए प्रतिरोध के एक उच्च डिग्री के लिए योगदान2। एंटीबायोटिक्स अभी भी जैविक फिल्म संक्रमण के लिए प्रमुख उपचार कर रहे हैं, हालांकि जैविक फिल्मों पर एंटीबायोटिक दवाओं के प्रभाव सीमित हैं । यह पहले से दिखाया गया है कि जैविक फिल्मों में कोशिकाओं को 10-१,००० बार और अधिक एंटीबायोटिक दवाओं के लिए अपने planktonic समकक्षों की तुलना में प्रतिरोधी रहे है3। इस प्रकार, वैकल्पिक रणनीतियों के लिए इस मुद्दे पर जीत की जरूरत है ।
pst, जीवाणु संक्रमण के लिए एक वैकल्पिक उपचार, photosensitizers को सक्रिय करने के लिए एक उपयुक्त तरंग दैर्ध्य के प्रकाश का उपयोग करता है । यह प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS), जो कोशिका दीवार में खलल डालने से कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए घातक हैं के उत्पादन की ओर जाता है, एंजाइमों को निष्क्रिय, और हानिकारक डीएनए4। इस बहु-लक्ष्य विशेषता यह मुश्किल जीवाणुओं के लिए pst उपचार के प्रतिरोध को विकसित करने के लिए बनाता है ।
जीवाणु और कवक पर pst के प्रभाव रोगाणुरोधी, कई photosensitizers, जैसे toluidine नीला, मैलाकाइट ग्रीन, methylene नीला, क्लोरीन e6, और porphyrins के साथ, की पिछली रिपोर्टों में अध्ययन किया गया है5,6, 7,8,9,10,11,12,13. 5-ाला, वास् तविक photosensitizer की एक दवा, PpIX, इसका छोटा आणविक भार और द्रुत ूमाणपऽ12,14की विशेषता है । ये फायदे एक चिकित्सीय आवेदन के रूप में ाला-pst प्रमुख क्षमता देते हैं । हालांकि planktonic जीवाणुओं पर ाला-pst का प्रभाव कई समूहों द्वारा अध्ययन किया गया है12, बैक्टीरियल फिल्म पर रोगाणुरोधी-pst के प्रभाव का अभी तक आविर्भाव नहीं हुआ है. इस बीच, पिछले अध्ययनों के बीच परिणामों की तुलना करना कठिन है । एक कारण यह है कि विविध समूहों द्वारा विभिंन प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाता है । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक इन विट्रो मॉडल के एक अला-pst हमारे पिछले काम15पर आधारित प्रणाली । इस मॉडल के प्रभाव CFU गणना और CLSM के साथ धुंधला की व्यवहार्यता की पुष्टि की थी ।
Protocol
Representative Results
Discussion
pst कैंसर के उपचार के लिए एक अच्छी तरह से अध्ययन चिकित्सा गया है क्योंकि यह अधिक से अधिक १०० साल पहले18का आविष्कार किया गया था । पिछले दशक में, pst एक रोगाणुरोधी रणनीति के रूप में लागू किया गया है और क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के युवा विद्वानों के लिए चीन के राष्ट्रीय प्रकृति विज्ञान फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया (no. ८१३००८१०), शंघाई युवा डॉक्टर प्रशिक्षण कार्यक्रम (सं. २०१४१०५७), और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (८१६७१९८२, ८१२७१७९१ और ८१५७१९५५) । हम इस पांडुलिपि की तैयारी के दौरान भाषायी सहायता प्रदान करने के लिए LetPub (www.letpub.com) का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे ।
Materials
| Tryptone Soya Broth (TSB) | OXOID | CM0129B | |
| Tryptone Soya Agar (TSA) | OXOID | CM0131 | |
| SYTO9 | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Propidium iodide (PI) | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P3292 | |
| 5-aminolevulinic acid (ALA) | Fudan Zhangjiang Bio-Pharm | 3.1 | |
| Staphylococcus aureus strain USA300 | / | / | The source of USA 300 references “Tenover FC, Goering RV. J Antimicrob Chemother. 2009 Sep; 64(3):441-6”. |
| Staphylococcus aureus clinical strains (C1-C3) | / | / | All clinical strains were isolated from patients with chronic rhinosinusitis in the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye and ENT Hospital of Fudan University [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627]. |
| 96-well microplate | Corning Inc | 3599 | Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile |
| Fluorodish | NEST Biotechnology | 801001 | Glass bottom, Non-pyrogenic |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf microcentrifuge 5417 | Eppendorf | Z365998 | SIGMA | |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE4000 | MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shakers |
| Light emitting diode (LED) | Wuhan Yage Optic and Electronic Technique CO | LED-IB | |
| Leica TCS SP8 confocal laser-scanning microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica LAS AF software | Leica Microsystems | ||
| IMARIS software | Bitplane |
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