In Vitro модель для изучения воздействия 5-аминолевулиновой кислоты-опосредованной фотодинамической терапии на золотистый стафилококк биопленки
Summary
Эта рукопись описывает протокол для изучения Антимикробный эффект 5-аминолевулиновой кислоты опосредованной фотодинамической терапии (ALA-PDT) на золотистый стафилококк биопленки. Этот протокол может использоваться для разработки в vitro модель для изучения в будущем лечении бактериальных биопленок с PDT.
Abstract
Золотистый стафилококк (S. aureus) является общей человеческой возбудителя, который вызывает гноеродной и системных инфекций. S. aureus инфекции трудно искоренить не только из-за появления устойчивых к антибиотикам штаммов, но и ее способность формы биопленки. Недавно фотодинамическая терапия (PDT) указан как один из потенциальных методов лечения для контроля инфекции биопленки. Однако чтобы улучшить наши знания о его влиянии на бактериальных биопленок, а также основных механизмов необходимы дальнейшие исследования. Эта рукопись описывает модель в vitro ФДТ с 5-аминолевулиновой кислоты (5-ALA), предшественник фактической фотосенсибилизатора, протопорфирин IX (PpIX). Вкратце, Зрелые S. aureus биоплёнки были инкубировали с Ала и затем подвергаются света. Впоследствии антибактериальный эффект ALA-PDT на S. aureus биопленки был количественно путем расчета колонии, образуя единиц (CFUs) и визуализированное жизнеспособности флуоресцентные окрашивание через Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM). Представитель результаты показали сильный антибактериальный эффект ALA-PDT на S. aureus биопленки. Этот протокол является простой и могут быть использованы для разработки в vitro модель для изучения обращения S. aureus биоплёнки с ALA-PDT. В будущем она может также ссылаться на PDT исследований с использованием других фотосенсибилизаторов для различных штаммов бактерий с минимальными изменениями.
Introduction
S. aureus является важным грамположительных возбудителя, который колонизирует кожу и слизистую оболочку человека хостов. Его способность формы биоплёнки считается важным аспектом его патогенез1. Бактериальные биопленки – сообщество бактерий, внедренные в матрицу собственного производства, которая состоит из внеклеточного полимерных веществ, включая полисахарид, ДНК и белка. Эта матрица играет значительную роль в сохранении бактериальных инфекций, способствует высокая степень сопротивления для иммунной системы человека и текущих антимикробной терапии2. Антибиотики являются по-прежнему основных лечения для инфекции биопленки, хотя влияние антибиотиков на биоплёнки ограничены. Ранее показано, что клетки в биопленки 10 – 1000 раз более устойчивы к антибиотикам, по сравнению с их планктонных коллегами3. Таким образом чтобы завоевать этот вопрос необходимы альтернативные стратегии.
PDT, альтернативное лечение для лечения бактериальных инфекций, использует свет соответствующей длины волны для того чтобы активировать фотосенсибилизаторов. Это приводит к производству реактивнооксигенных видов (ров), которые являются смертельным для клеток-мишеней, нарушения клеточной стенки, инактивируют ферменты и повреждения ДНК4. Эта характеристика многолетних целевых делает его трудным для бактерий развивается устойчивость к лечению PDT.
Антимикробный эффект PDT на бактериальных и грибковых биопленки, с несколькими фотосенсибилизаторов, например толуидиновый синий, зеленый малахит, метиленовый синий, хлора e6 и порфиринов, был изучен в предыдущих докладах5,6, 7,8,9,10,11,12,13. 5-ALA, пролекарство фактической фотосенсибилизатора, PpIX, характеризуется своей небольшой молекулярной массой и быстрое разминирование12,14. Эти преимущества дают ALA-PDT огромный потенциал в качестве терапевтического применения. Хотя многие группы12исследовано влияние ALA-PDT на планктонные бактерий, Антимикробный эффект ALA-PDT на бактериальных биопленок еще не выяснены. Между тем трудно сравнить результаты предыдущих исследований. Одной из причин является, что различные протоколы используются различными группами. Таким образом этот протокол описывает в vitro модель ALA-PDT системы, основанной на нашей предыдущей работы15. Влияние этой модели была подтверждена CFU расчет и жизнеспособности, окрашивание с CLSM.
Protocol
Representative Results
Discussion
PDT был хорошо изученных терапии для лечения рака, поскольку он был изобретен более чем 100 лет назад18. За последнее десятилетие PDT применялся в качестве антимикробного стратегии и показал эффективность против некоторых устойчивых к антибиотикам болезнетворных бактерий<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась национальный характер науки фонд Китая для молодых ученых (№ 81300810), Шанхай молодой доктор учебной программы (№ 20141057) и национальные естественные науки фонд Китая (81671982, 81271791 и 81571955). Мы хотели бы поблагодарить LetPub (www.letpub.com) для обеспечения языковой помощи в ходе подготовки этой рукописи.
Materials
| Tryptone Soya Broth (TSB) | OXOID | CM0129B | |
| Tryptone Soya Agar (TSA) | OXOID | CM0131 | |
| SYTO9 | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Propidium iodide (PI) | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P3292 | |
| 5-aminolevulinic acid (ALA) | Fudan Zhangjiang Bio-Pharm | 3.1 | |
| Staphylococcus aureus strain USA300 | / | / | The source of USA 300 references “Tenover FC, Goering RV. J Antimicrob Chemother. 2009 Sep; 64(3):441-6”. |
| Staphylococcus aureus clinical strains (C1-C3) | / | / | All clinical strains were isolated from patients with chronic rhinosinusitis in the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye and ENT Hospital of Fudan University [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627]. |
| 96-well microplate | Corning Inc | 3599 | Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile |
| Fluorodish | NEST Biotechnology | 801001 | Glass bottom, Non-pyrogenic |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf microcentrifuge 5417 | Eppendorf | Z365998 | SIGMA | |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE4000 | MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shakers |
| Light emitting diode (LED) | Wuhan Yage Optic and Electronic Technique CO | LED-IB | |
| Leica TCS SP8 confocal laser-scanning microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica LAS AF software | Leica Microsystems | ||
| IMARIS software | Bitplane |
References
- Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45 (4), 999-1007 (2001).
- Rabin, N., et al. Biofilm formation mechanisms and targets for developing antibiofilm agents. Future Med Chem. 7 (4), 493-512 (2015).
- Mah, T. F., O’Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).
- Sharma, M., et al. Toluidine blue-mediated photodynamic effects on staphylococcal biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 52 (1), 299-305 (2008).
- Rosa, L. P., da Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. In vitro effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy (APDT) using a 660 nm laser and malachite green dye in Staphylococcus aureus biofilms arranged on compact and cancellous bone specimens. Lasers Med Sci. 29 (6), 1959-1965 (2014).
- Rosa, L. P., Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. Effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy using a 660 nm laser and methyline blue dye for inactivating Staphylococcus aureus biofilms in compact and cancellous bones: An in vitro study. Photodiagnosis Photodyn Ther. 12 (2), 276-281 (2015).
- Mai, B., et al. The antibacterial effect of sinoporphyrin sodium photodynamic therapy on Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cultures. Lasers Surg Med. 48 (4), 400-408 (2016).
- Gandara, L., Mamone, L., Bohm, G. C., Buzzola, F., Casas, A. Enhancement of photodynamic inactivation of Staphylococcus aureus biofilms by disruptive strategies. Lasers Med Sci. 32 (8), 1757-1767 (2017).
- Baltazar, L. M., et al. Antimicrobial photodynamic therapy: an effective alternative approach to control fungal infections. Front Microbiol. 6, 202 (2015).
- Fernandes, T., Bhavsar, C., Sawarkar, S., D’Souza, A. Current and novel approaches for control of dental biofilm. Int J Pharm. 536 (1), 199-210 (2017).
- De Sordi, L., et al. Development of Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy (PACT) for Clostridium difficile. PLoS One. 10 (8), e0135039 (2015).
- Harris, F., Pierpoint, L. Photodynamic therapy based on 5-aminolevulinic acid and its use as an antimicrobial agent. Med Res Rev. 32 (6), 1292-1327 (2012).
- Donnelly, R. F., McCarron, P. A., Tunney, M. M. Antifungal photodynamic therapy. Microbiol Res. 163 (1), 1-12 (2008).
- Shi, H., Li, J., Zhang, H., Zhang, J., Sun, H. Effect of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy on Candida albicans biofilms: An in vitro study. Photodiagnosis Photodyn Ther. 15, 40-45 (2016).
- Zhang, Q. Z., et al. 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy and its strain-dependent combined effect with antibiotics on Staphylococcus aureus biofilm. PLoS One. 12 (3), 0174627 (2017).
- Chang, Y. C., et al. Rapid single cell detection of Staphylococcus aureus by aptamer-conjugated gold nanoparticles. Sci Rep. 3, 1863 (2013).
- Barra, F., et al. Photodynamic and Antibiotic Therapy in Combination to Fight Biofilms and Resistant Surface Bacterial Infections. Int J Mol Sci. 16 (9), 20417-20430 (2015).
- St Denis, T. G., et al. All you need is light: antimicrobial photoinactivation as an evolving and emerging discovery strategy against infectious disease. Virulence. 2 (6), 509-520 (2011).
- O’Neill, J. F., Hope, C. K., Wilson, M. Oral bacteria in multi-species biofilms can be killed by red light in the presence of toluidine blue. Lasers Surg Med. 31 (2), 86-90 (2002).
- Li, X., et al. Effects of 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy on antibiotic-resistant staphylococcal biofilm: an in vitro study. J Surg Res. 184 (2), 1013-1021 (2013).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
- Elias, S., Banin, E. Multi-species biofilms: living with friendly neighbors. FEMS Microbiol Rev. 36 (5), 990-1004 (2012).
- Wu, J., et al. Design and Proof of Programmed 5-Aminolevulinic Acid Prodrug Nanocarriers for Targeted Photodynamic Cancer Therapy. ACS Appl Mater Interfaces. 9 (17), 14596-14605 (2017).
