En In Vitro -modell för att studera effekten av 5-aminolevulinsyra-medierad fotodynamisk terapi på Staphylococcus aureus Biofilm
Summary
Detta manuskript beskriver ett protokoll för att studera den antimikrobiella effekten av 5-aminolevulinsyra syra-medierad fotodynamisk terapi (ALA-PDT) på en Staphylococcus aureus biofilm. Detta protokoll kan användas för att utveckla en in vitro- modell för att studera behandling av bakteriell biofilm med PDT i framtiden.
Abstract
Staphylococcus aureus (S. aureus) är en gemensam mänsklig patogen, som orsakar pyogena och systemiska infektioner. S. aureus -infektioner är svåra att utrota inte bara på grund av uppkomsten av antibiotikaresistenta stammar utan också dess förmåga att bilda biofilmer. Nyligen, fotodynamisk terapi (PDT) har angivits som en av de potentiella behandlingarna för styrning av biofilm infektioner. Dock ytterligare krävs studier för att förbättra vår kunskap om dess effekt på bakteriell biofilm, liksom de bakomliggande mekanismerna. Detta manuskript beskriver en in vitro modell av PDT med 5-aminolevulinsyra (5-ALA), en föregångare till den faktiska photosensitizer, protoporfyrin IX (PpIX). Kort, Mogen S. aureus biofilmer var inkuberas med ALA och sedan utsätts för ljus. Därefter, var den antibakteriella effekten av ALA-PDT på S. aureus biofilm kvantifieras genom att beräkna den kolonibildande enheter (CFUs) och visualiseras av livskraft fluorescerande färgning via confocal laserscanning mikroskopi (CLSM). Representativa resultat visade en stark antibakteriell effekt av ALA-PDT på S. aureus biofilmer. Detta protokoll är enkel och kan användas för att utveckla en in vitro- modell för att studera behandling av S. aureus biofilmer med ALA-PDT. I framtiden kan det också refereras i PDT studier utnyttjar andra photosensitizers för olika bakteriestammar med minimala justeringar.
Introduction
S. aureus är en viktig grampositiva patogener som colonizes hud och slemhinnor av mänskliga värdar. Dess förmåga att bilda biofilmer anses vara en viktig aspekt av dess patogenes1. Bakteriell biofilm är en gemenskap av bakterier inbäddade i en egenproducerad matris, som består av extracellulära polymera substanser, inklusive polysackarid, DNA och protein. Denna matris har en betydande roll i fortsatta bakteriella infektioner, bidrar till en hög grad av motstånd mot människans immunsystem och nuvarande antimikrobiella behandlingar2. Antibiotika är fortfarande den viktigaste behandlingen för biofilm infektioner, även om effekterna av antibiotika på biofilmer är begränsade. Det har tidigare visat att celler i biofilmer är 10 – 1000 gånger mer resistent mot antibiotika jämfört med deras plankton motsvarigheter3. Således behövs alternativa strategier för att erövra denna fråga.
PDT, en alternativ behandling för bakteriella infektioner, använder ljuset från en lämplig våglängd för att aktivera photosensitizers. Detta leder till produktion av reaktiva syreradikaler (ROS), som är dödliga för målceller av hormonstörande cellväggen, inactivating enzymer, och skadar DNA4. Detta flera mål kännetecken gör det svårt för bakterier att utveckla resistens mot PDT behandling.
Den antimikrobiella effekten av PDT om bakteriell och fungal biofilmer, med flera photosensitizers, såsom toluidin blå, malakit green, metylenblått, klor e6 och porfyriner, har studerats i tidigare rapporter5,6, 7,8,9,10,11,12,13. 5-ALA, en prodrug till den faktiska photosensitizer, PpIX, kännetecknas av dess små molekylvikt och snabb clearance12,14. Dessa fördelar ger ALA-PDT stor potential som en terapeutisk applikation. Även om effekten av ALA-PDT på plankton bakterier har studerats av många grupper12, klarlagd antimikrobiella effekten av ALA-PDT på bakteriell biofilm ännu inte. Samtidigt är det svårt att jämföra resultaten mellan tidigare studier. En av anledningarna är att de olika protokoll som används av olika grupper. Alltså beskriver det här protokollet en in vitro- modell av ett ALA-PDT baserat på våra tidigare arbete15. Effekten av denna modell bekräftades av CFU beräkning och livskraft färgning med CLSM.
Protocol
Representative Results
Discussion
PDT har varit en väl studerat terapi för behandling av cancer eftersom det uppfanns mer än 100 år sedan18. Under det senaste decenniet, PDT har tillämpats som en antimikrobiell strategi och har visat effektiviteten mot vissa antibiotikaresistenta patogena bakterier12. Jämfört med tillståndet plankton, verkar bakteriell biofilm vara mer resistent mot behandling med antibiotika3, medan effekten av ALA-PDT på biofilmer inte har fullt utretts ä…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av nationell natur Science Foundation i Kina för unga forskare (nr 81300810), Shanghai ung läkare träningsprogram (nr 20141057) och National Natural Science Foundation Kina (81671982, 81271791 och 81571955). Vi vill tacka LetPub (www.letpub.com) för att tillhandahålla språkligt stöd under utarbetandet av detta manuskript.
Materials
| Tryptone Soya Broth (TSB) | OXOID | CM0129B | |
| Tryptone Soya Agar (TSA) | OXOID | CM0131 | |
| SYTO9 | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Propidium iodide (PI) | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P3292 | |
| 5-aminolevulinic acid (ALA) | Fudan Zhangjiang Bio-Pharm | 3.1 | |
| Staphylococcus aureus strain USA300 | / | / | The source of USA 300 references “Tenover FC, Goering RV. J Antimicrob Chemother. 2009 Sep; 64(3):441-6”. |
| Staphylococcus aureus clinical strains (C1-C3) | / | / | All clinical strains were isolated from patients with chronic rhinosinusitis in the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye and ENT Hospital of Fudan University [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627]. |
| 96-well microplate | Corning Inc | 3599 | Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile |
| Fluorodish | NEST Biotechnology | 801001 | Glass bottom, Non-pyrogenic |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf microcentrifuge 5417 | Eppendorf | Z365998 | SIGMA | |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE4000 | MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shakers |
| Light emitting diode (LED) | Wuhan Yage Optic and Electronic Technique CO | LED-IB | |
| Leica TCS SP8 confocal laser-scanning microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica LAS AF software | Leica Microsystems | ||
| IMARIS software | Bitplane |
References
- Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45 (4), 999-1007 (2001).
- Rabin, N., et al. Biofilm formation mechanisms and targets for developing antibiofilm agents. Future Med Chem. 7 (4), 493-512 (2015).
- Mah, T. F., O’Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).
- Sharma, M., et al. Toluidine blue-mediated photodynamic effects on staphylococcal biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 52 (1), 299-305 (2008).
- Rosa, L. P., da Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. In vitro effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy (APDT) using a 660 nm laser and malachite green dye in Staphylococcus aureus biofilms arranged on compact and cancellous bone specimens. Lasers Med Sci. 29 (6), 1959-1965 (2014).
- Rosa, L. P., Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. Effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy using a 660 nm laser and methyline blue dye for inactivating Staphylococcus aureus biofilms in compact and cancellous bones: An in vitro study. Photodiagnosis Photodyn Ther. 12 (2), 276-281 (2015).
- Mai, B., et al. The antibacterial effect of sinoporphyrin sodium photodynamic therapy on Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cultures. Lasers Surg Med. 48 (4), 400-408 (2016).
- Gandara, L., Mamone, L., Bohm, G. C., Buzzola, F., Casas, A. Enhancement of photodynamic inactivation of Staphylococcus aureus biofilms by disruptive strategies. Lasers Med Sci. 32 (8), 1757-1767 (2017).
- Baltazar, L. M., et al. Antimicrobial photodynamic therapy: an effective alternative approach to control fungal infections. Front Microbiol. 6, 202 (2015).
- Fernandes, T., Bhavsar, C., Sawarkar, S., D’Souza, A. Current and novel approaches for control of dental biofilm. Int J Pharm. 536 (1), 199-210 (2017).
- De Sordi, L., et al. Development of Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy (PACT) for Clostridium difficile. PLoS One. 10 (8), e0135039 (2015).
- Harris, F., Pierpoint, L. Photodynamic therapy based on 5-aminolevulinic acid and its use as an antimicrobial agent. Med Res Rev. 32 (6), 1292-1327 (2012).
- Donnelly, R. F., McCarron, P. A., Tunney, M. M. Antifungal photodynamic therapy. Microbiol Res. 163 (1), 1-12 (2008).
- Shi, H., Li, J., Zhang, H., Zhang, J., Sun, H. Effect of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy on Candida albicans biofilms: An in vitro study. Photodiagnosis Photodyn Ther. 15, 40-45 (2016).
- Zhang, Q. Z., et al. 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy and its strain-dependent combined effect with antibiotics on Staphylococcus aureus biofilm. PLoS One. 12 (3), 0174627 (2017).
- Chang, Y. C., et al. Rapid single cell detection of Staphylococcus aureus by aptamer-conjugated gold nanoparticles. Sci Rep. 3, 1863 (2013).
- Barra, F., et al. Photodynamic and Antibiotic Therapy in Combination to Fight Biofilms and Resistant Surface Bacterial Infections. Int J Mol Sci. 16 (9), 20417-20430 (2015).
- St Denis, T. G., et al. All you need is light: antimicrobial photoinactivation as an evolving and emerging discovery strategy against infectious disease. Virulence. 2 (6), 509-520 (2011).
- O’Neill, J. F., Hope, C. K., Wilson, M. Oral bacteria in multi-species biofilms can be killed by red light in the presence of toluidine blue. Lasers Surg Med. 31 (2), 86-90 (2002).
- Li, X., et al. Effects of 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy on antibiotic-resistant staphylococcal biofilm: an in vitro study. J Surg Res. 184 (2), 1013-1021 (2013).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
- Elias, S., Banin, E. Multi-species biofilms: living with friendly neighbors. FEMS Microbiol Rev. 36 (5), 990-1004 (2012).
- Wu, J., et al. Design and Proof of Programmed 5-Aminolevulinic Acid Prodrug Nanocarriers for Targeted Photodynamic Cancer Therapy. ACS Appl Mater Interfaces. 9 (17), 14596-14605 (2017).
