Isolierung der magensaftresistenten Gliazellen aus der Submukosa und Lamina Propria der Erwachsenen Maus
Summary
Hier beschreiben wir die Isolation der magensaftresistenten Gliazellen aus Darm-Submukosa mit sequentiellen EDTA Inkubationen chelatkomplex zweiwertigen kationen und dann Inkubation in nicht-enzymatische Zelle-Recovery-Lösung. Beschichtung der daraus resultierenden Zellsuspension auf Poly-D-Lysin und Laminin führt zu einer hoch angereicherten Kultur der submucosal Gliazellen für Funktionsanalyse.
Abstract
Das Enterische Nervensystem (ENS) besteht aus Neuronen und magensaftresistenten Gliazellen (EGCs), die innerhalb der glatten muskelwand, Submukosa und Lamina Propria befinden. EGCs im Darm Homöostase durch die Freisetzung von verschiedenen trophischen Faktoren eine wichtige Rolle spielen und dazu beitragen, die Integrität der epithelialen Barriere. Die meisten Studien von enterischen Glia Primärkulturen verwenden Zellen isoliert von den Auerbach-Plexus nach enzymatischer Dissoziation. Hier ist eine nicht-enzymatische Methode zu isolieren und Kultur EGCs aus dem Darm Submukosa und Lamina Propria beschrieben. Nach der manuellen Entfernung der die longitudinale Muskelschicht wurden von der Lamina Propria und Submukosa sequentielle HEPES gepufferten EDTA Inkubationen gefolgt von Inkubation in kommerziell erhältlichen nicht-enzymatische Zelle-Recovery-Lösung mit EGCs befreit. Die EDTA Inkubationen ausreichten, um die meisten der epithelialen Schleimhaut aus der Lamina Propria, so dass die Zelle-Recovery-Lösung, die submucosal EGCs befreien Streifen. Alle restlichen Lamina Propria und glatte Muskulatur wurde zusammen mit Auerbach Glia verworfen. EGCs wurden leicht durch ihre Fähigkeit, glial fibrillary sauren Protein (GFAP) auszudrücken. Nur etwa 50 % der Zellsuspension enthaltenen GFAP + Zellen nach Abschluss Gewebe Inkubationen und vor der Beschichtung auf dem Poly-D-Lysin/Laminin-Substrat. Jedoch nach 3 Tagen der Kultivierung der Zellen glial Cell-derived Neurotrophic factor (GDNF)-mit Kultur, Medien, die Zellpopulation, die Einhaltung der Substrat-beschichteten Platten bestehend aus > 95 % enterischen Glia. Wir haben eine Hybrid-Maus-Linie durch Zucht eine hGFAP-Cre-Maus, um die ROSA-TdTomato-Reporter-Linie, den Anteil der Astroglia + Zellen mit körpereigenen Zellen Fluoreszenz zu verfolgen. Somit kann nicht Auerbach enterischen Glia durch nicht-enzymatische Methoden isoliert und für mindestens 5 Tage kultiviert.
Introduction
Interesse an der Funktion des enterischen Glia-Zellen (EGCs) stieg stetig aufgrund ihrer anerkannten Rollen im Darm Integrität und Homöostase1,2. Darüber hinaus variieren EGCs nach ihrer Lage entlang der Länge der GI-Trakt3,4. EGCs Version verschiedenen trophische Faktoren einschließlich glial Cell-derived Neurotrophic Factor (GDNF), dazu beitragen, Darm-Motilität1,5 und reagieren auf mikrobielle Nebenprodukte6,7. Studien haben gezeigt, dass die EGC Bevölkerung heterogen ist und dass ihre Funktion ändert sich je nachdem, ob sie submucosal oder befinden sich in Auerbach Plexus1,7. Tragen beispielsweise EGCs innerhalb der Submukosa auf engen Kreuzungen8. Differential GFAP Ausdruck und Phosphorylierung in EGCs haben mit der Parkinson-Krankheit, was auf ihre mögliche Verbindung zu den Darm Phänotyp von dieser Störung9verbunden. Vor kurzem wurde festgestellt, dass der Verlust der nuklearen Protein Menin in isolierten Kulturen des EGCs aus den proximalen Darm Submukosa induzieren Ausdruck der Hormon Gastrin10ausreichte. Infolgedessen wurde vorgeschlagen, dass EGCs den Ursprung der Zwölffingerdarm Gastrinomas, eine Art von neuroendokrinen Tumor10sein könnte. Gemeinsam, unterstreichen diese Beispiele die Relevanz des Studiums, das Verhalten und die Funktion der isolierten EGCs neuropathischen Erkrankungen und Krebs-11.
Die Herausforderung im Bereich bleibt wie zu isolieren und eine oder beide EGC Populationen in-vitro-Studie. Linie Spur Experimente zeigten, dass EGCs in der Submukosa und Lamina Propria aus Vorläuferzellen in Auerbach Plexus7stammen. Zwar gibt es mehrere veröffentlichten Isolierung Protokolle zur Verfügung, um die Kulturen der Auerbach EGCs12,13,14,15,16,17zu generieren, 18,19, keine richtet sich speziell Isolierung der submucosal/Lamina Propria EGC Bevölkerung. Bestehende Protokolle zur EGC Isolierung verwenden speziell eine Kombination der mechanischen Trennung oder Mikrodissektion der glatten Muskulatur kombiniert mit enzymatischen Dissoziation, schließlich verwerfen der Schleimhaut Zellschicht.
Dieses Manuskript soll die Schritte aus, um nicht-enzymatisch zu isolieren, primäre EGCs aus der Lamina Propria für in-vitro- Studien zeigen. Da gibt es keine Markierungen, die speziell Auerbach EGCs von denen in der Submukosa unterscheiden, wurde die räumliche Trennung der epithelialen Schleimhaut aus der glatten Muskulatur ausgenutzt, um submucosal EGCs zu isolieren. Darüber hinaus wurden durch die Kombination von EDTA Chelat mit nicht-enzymatische Dissoziation, EGCs isoliert von der Submukosa im Gegensatz zu der glatten Muskulatur, die zusammen mit den zugehörigen inter-Auerbach EGCs verworfen wurde. Weitere Trennung der Submukosa und Lamina Propria EGCs durch Kultivierung der Zellen auf glial Cell-freundliche Substrate, z. B. Poly-D-Lysin und Laminin aufgetreten.
Protocol
Representative Results
Discussion
EGCs spielen eine wichtige Rolle im Darm Homöostase, und es ist wichtig, zu isolieren und studieren sie in Vitro. In diesem Protokoll wurde eine einfache Methode zur Isolierung von EGCs aus der Lamina Propria des Darmes Erwachsenen Maus eingeführt, um enterischen Glia Funktion zu untersuchen.
Entfernen der anhaftende Mesenterium und LMMP mit einem Wattestäbchen entfernt einige der Inter-Auerbach-Glia wohnen zwischen längs- und kreisförmigen Muskels, erhöht die Zugänglichkeit de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Unterstützung von R37 DK045729 (um JLM), R01 AR060837 (zu HX) und der University of Michigan Magen-Darm-Research Center Molekulare Kern P30 DK034933 anerkennen.
Materials
| Poly-D lysine (1 mg/ml stock) | Sigma | A-003-E | Dilute 1:10 |
| Laminin (0.5 mg/ml stock) | Sigma | L4544 | Dilute to 10 µg/mL on ICE |
| EDTA (0.5M) | Lonza | 51201 | Dilute 1:100 in DPBS |
| HEPES (1 M) | Corning | 36216004 | Dilute 1:100 in DPBS |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin (50mg/mL stock) | Life Technologies | 15750060 | |
| GDNF (10 µg stock) | Sigma | SRP3200 | |
| L-Glutamine (200 mM stock) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Chicken anti-GFAP | Thermo Fisher Scientific | PA1-10004 | |
| Goat anti-a-Smooth Muscle Actin | Abcam | ab112022 | |
| Mouse anti-Pgp9.5 | Novus Biologicals | NB600-1160 | |
| Goat anti-E-cadherin | R&D Systems | AF748 | |
| Rabbit S100 | Abcam | ab34686 | |
| Mouse p75 NTR | Millipore | MAB5592 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken IgY | Invitrogen | A-11039 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | R-37119 | |
| Prolong Gold antifade Reagent with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fungizone (Amphotericin B) 250 µg/ml | Life Technologies | 15290-018 | |
| L-Fura-2-AM | Invitrogen | F-14201 | |
| CCK peptide | Anaspec, Fremont, CA | AS-20741 | |
| Gastrin peptide (Gastrin-17) | Abbiotec, Bloomington, IN | 350188 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (100 µm) | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (40 µm) | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Disposable Serologic Pipet 5 ml | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Life Technologies | 25200-056 |
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