Aislamiento de las células gliales entéricas de la Submucosa y la lámina propia del ratón adulto
Summary
Aquí, describimos el aislamiento de las células entéricas glial de la intestinal submucosa con incubaciones secuenciales de EDTA para quelar cationes divalentes y luego de incubación en la solución de recuperación no enzimática de la célula. La suspensión de células resultante de poly-D-lisina y laminina de la galjanoplastia resulta en una cultura altamente enriquecida de las células gliales submucosas de análisis funcional.
Abstract
El sistema nervioso entérico (ENS) consiste en neuronas y células gliales entéricas (EGCs) que residen dentro de la pared de músculo liso, submucosa y lámina propia. EGCs desempeñan papeles importantes en la homeostasis intestinal a través de la liberación de factores tróficos y contribuyan a la integridad de la barrera epitelial. Mayoría de los estudios de cultivos primarios de gliales entéricas usa células aisladas desde el plexo mientérico después de disociación enzimática. Aquí, se describe un método no enzimático para aislar y la cultura EGCs intestinal submucosa y lámina propia. Después de la extracción manual de la capa de músculo longitudinal, EGCs fueron liberados de la lámina propia y submucosa con incubaciones de EDTA tamponado con HEPES secuenciales seguidas por incubación en solución de recuperación de la célula no enzimáticos disponibles en el mercado. Las incubaciones de EDTA fueron suficientes para la mayoría de la mucosa epitelial de la lámina propia, que permite la solución de recuperación de la célula liberar el EGCs submucosas de la tira. Cualquier residual propria de la lámina y del músculo liso fue descartado junto con la glía mientérico. EGCs fueron fácilmente identificados por su capacidad para expresar la proteína ácida fibrilosa glial (GFAP). Sólo alrededor del 50% de la suspensión de células contienen células GFAP + incubaciones de tejido y antes de revestimiento sobre el sustrato de poly-D-lisina/laminina. Sin embargo, después de 3 días de cultivo de las células de factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF)-que contienen medios de cultivo, conformada por la población de células adheridas a las placas recubiertas de sustrato > 95% de glía entérica. Hemos creado una línea de ratón híbrido por un ratón hGFAP-Cre a la línea de reportero ROSA tdTomato para realizar un seguimiento el porcentaje de células GFAP + usando fluorescencia endógena de la célula de la cría. Así, glía entérica mientérico no puede ser aislado por métodos no enzimáticos y cultivado durante al menos 5 días.
Introduction
Interés en la función de las células gliales entéricas (EGCs) ha aumentado constantemente debido a sus reconocidas funciones en la tripa integridad y homeostasis1,2. Además, EGCs varían según su localización a lo largo de la longitud del tracto GI3,4. EGCs liberar varios factores tróficos como el factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF), contribuyen a intestino motilidad1,5 y responder a los subproductos microbianos6,7. Los estudios han indicado que la población de EGC es heterogénea y que su función varía dependiendo de si son submucosos o residen en el mientérico plexo1,7. Por ejemplo, EGCs dentro de la submucosa contribuyen a ensambladuras apretadas8. Diferencial de expresión de GFAP y fosforilación en EGCs se han relacionado con la enfermedad de Parkinson, lo que sugiere su posible vinculación al fenotipo intestinal de este desorden9. Recientemente, se observó que la pérdida de la proteína nuclear menin en cultivos aislados de EGCs de la submucosa intestinal proximal era suficiente para inducir la expresión de la hormona gastrina10. Como resultado, se propuso que EGCs podrían ser el origen de los gastrinomas duodenales, un tipo de tumor neuroendocrino10. Colectivamente, estos ejemplos ponen de relieve la importancia de estudiar el comportamiento y la función de EGCs aislados en desórdenes neuropáticos y cáncer11.
El desafío en el campo sigue siendo cómo aislar y estudiar uno o ambos EGC poblaciones en vitro. Linaje rastro experimentos demostraron que EGCs en la submucosa y la lámina propia se originan de células progenitoras en el plexo mientérico del7. Aunque existen varios protocolos de aislamiento publicado disponible para generar culturas de mientérico EGCs12,13,14,15,16,17, 18,19, ninguno específicamente objetivos de aislamiento de la población de EGC propria de la lámina submucosa. Los protocolos existentes para el aislamiento de EGC en concreto utilizan una combinación de la separación mecánica o el microdissection del músculo liso combinado con disociación enzimática, desechando finalmente la capa de la célula de la mucosa.
El objetivo de este manuscrito es demostrar los pasos para aislar no enzimático EGCs primarias de la lámina propia para estudios en vitro . Puesto que hay no hay marcadores que distinguen específicamente EGCs mientérico de ésos en la submucosa, la separación espacial de la mucosa epitelial de la musculatura lisa fue explotada para aislar EGCs submucosas. Además, mediante la combinación de quelación de EDTA con disociación no enzimática, EGCs fueron aislados de la submucosa en contraste con el músculo liso, que fue descartado junto con las inter-mientérico asociado EGCs. Más separación de la submucosa y lámina propia EGCs producido por cultivo de las células de glial de la célula-ambiente sustratos, por ejemplo, poly-D-lisina y laminina.
Protocol
Representative Results
Discussion
EGCs desempeñan papeles importantes en la homeostasis intestinal, y es esencial para aislar y estudiar in vitro. En este protocolo, un método simple para aislar la lámina propia del intestino de ratón adulto EGCs fue introducido para estudiar la función glial entérica.
Quitar adherente mesentery y LMMP con un hisopo de algodón elimina algunos de la glia inter-mientérico que reside entre el músculo longitudinal y circular, aumenta la accesibilidad de buffers a la superficie de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean reconocer el apoyo de DK045729 R37 (a JLM), R01 AR060837 (de HX) y la Universidad de Michigan Gastrointestinal investigación de centro de Molecular P30 núcleo de DK034933.
Materials
| Poly-D lysine (1 mg/ml stock) | Sigma | A-003-E | Dilute 1:10 |
| Laminin (0.5 mg/ml stock) | Sigma | L4544 | Dilute to 10 µg/mL on ICE |
| EDTA (0.5M) | Lonza | 51201 | Dilute 1:100 in DPBS |
| HEPES (1 M) | Corning | 36216004 | Dilute 1:100 in DPBS |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin (50mg/mL stock) | Life Technologies | 15750060 | |
| GDNF (10 µg stock) | Sigma | SRP3200 | |
| L-Glutamine (200 mM stock) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Chicken anti-GFAP | Thermo Fisher Scientific | PA1-10004 | |
| Goat anti-a-Smooth Muscle Actin | Abcam | ab112022 | |
| Mouse anti-Pgp9.5 | Novus Biologicals | NB600-1160 | |
| Goat anti-E-cadherin | R&D Systems | AF748 | |
| Rabbit S100 | Abcam | ab34686 | |
| Mouse p75 NTR | Millipore | MAB5592 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken IgY | Invitrogen | A-11039 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | R-37119 | |
| Prolong Gold antifade Reagent with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fungizone (Amphotericin B) 250 µg/ml | Life Technologies | 15290-018 | |
| L-Fura-2-AM | Invitrogen | F-14201 | |
| CCK peptide | Anaspec, Fremont, CA | AS-20741 | |
| Gastrin peptide (Gastrin-17) | Abbiotec, Bloomington, IN | 350188 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (100 µm) | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (40 µm) | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Disposable Serologic Pipet 5 ml | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Life Technologies | 25200-056 |
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