Immunostimulerende Agent evaluatie: Lymfoïde weefsel extractie en injectie Route-afhankelijke dendritische cel activeren
Summary
Experimentele procedures voor de verdere winning van lymfatische weefsels voor het testen van lymfoïde dendritische cel activatie worden beschreven na behandeling van een immuniteitsverhoging nanomateriaal.
Abstract
Voor de evaluatie van een nieuwe therapeutische agent voor immunotherapie of vaccinatie is analyse van immuun cel activatie in het lymfatische weefsel essentieel. Hier, we onderzochten immunologische effecten van een immunostimulant roman lipide-DNA in nanoparticle vorm van beheer van de verschillende routes in de muis: orale, subcutane, intranasale struikrover, intraperitoneaal en intraveneuze. Deze injecties zal direct invloed uitoefenen op de immuunrespons en oogsten van lymfatische weefsels en analyse van de activering van dendritische cellen (DC) in de weefsels zijn cruciale onderdelen van deze evaluaties. De winning van mediastinale lymfklieren (mLNs) is belangrijk maar vrij complex vanwege de grootte en de locatie van dit orgel. Een stapsgewijze procedure voor het verzamelen van de inguïnale lymfeklieren (iLN), de mLN, en de milt en het analyseren van DC activering door stroom cytometry wordt beschreven.
Introduction
Immunologie en nanomaterialen vooruitgang hebben geleid tot een overvloed aan potentiële nieuwe therapeutische strategieën voor toepassingen in biologie, met inbegrip van de drug delivery en immunostimulation. Optimalisatie van de route van de administratie is een essentieel element beïnvloeden de effectiviteit van immunostimulerende agenten. Een immunostimulerende nanoparticle (INP) bestaande uit DNA is een nieuw ontwikkelde nano-immuun adjuvans zelf geassembleerd door microphase scheiding vanwege de amfifiele structuur van lipide-DNA1. Daarom, protocollen voor INP met betrekking tot beheer van de materiële1 in vivo via verschillende routes en drie procedures voor oogsten van passende weefsels zoals de inguïnale lymfeklieren (iLN), mediastinale LN (milj.), en de milt, zijn beschreven. Ten slotte, deze weefsels werden geanalyseerd voor dendritische cellen (DC) activeren, de meest krachtige presentatie van antigeen cellen in het immuunsysteem. Dit protocol kan ook worden toegepast voor de beoordeling van de antigenen, antilichamen of andere immuun hulpstoffen2.
We testten de INP formulering, want het is een agent die heeft aangetoond grote belofte. INP is een Toll-like receptor 9 (TLR9) adjuvante materiaal dat bevat van nucleïnezuren, voor welke beoordeling van immunostimulation doeltreffendheid vereist is om te testen verschillende injectie methoden3. In dit verband is de stimulatie van DCs een potente eindpunt voor in vivo evaluatie. Nadat het antigeen of immunostimulerende moleculen zijn in de perifere weefsels of bloed door DCs phagocytosed, migreren deze cellen naar lymfoïde organen zoals de milt en de LNs4,5. Dus, DC activering werd geanalyseerd in de milt, iLN en mLN van de geïnjecteerde dieren. Goed oogsten van deze weefsels is daarom ook belangrijk voor de evaluatie van de immuunrespons op een roman adjuvante of ziekteverwekkers5. Dergelijke weefsel oogsten is ook belangrijk voor de ontwikkeling van een nieuwe immunologische methodologie als een kankertherapie. Bovendien, dit protocol kan worden gebruikt om te controleren of de efficiëntie van andere drugs, zoals anti-menselijke immunodeficiency virus therapeutics6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Veel vooruitgang in nanotechnologie en immunologie hebben bereikt door middel van therapeutische onderzoek voor drug delivery en immunostimulation. Zorgvuldige selectie van de injectie-methode is bekend als belangrijk voor immunostimulation, die was de focus van de huidige studie.
Verschillende injectie routes werden geëvalueerd voor een natuurlijk niet-giftige en biologisch afbreekbare op basis van DNA materiaal, INP (immunostimulerende nanoparticle), om te bepalen welke route het beste resu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gesteund door creatieve materialen ontdekking programma via de nationale onderzoek Stichting van Korea (NRF) gefinancierd door het ministerie van wetenschap, ICT en toekomst Planning (NRF-2017M3D1A1039421) en mariene biotechnologie-programma gefinancierd door de Ministerie van oceanen en visserij, Republiek Korea en een grant (20150220).
Materials
| Material | |||
| phosphate buffer saline | Corning | 21-040-CVR | Washing organs |
| (PBS, pH 7.4) | |||
| isoflurane solution | Aesica Queenborough limited | 26675-46-7 | Anesthesia process |
| Tuberculin 1mL syringe – | Junglim | N/A | Injection |
| 50 mL conical tube | S.P.L | 50050 | Anesthesia process |
| 1mL Insulin Syringe | (BD Ultra-FineTMII)_short needle | 324826 | Intramuscular Injection |
| DMEM High Glucose | Hyclone | SH30081.01 | Storing organs |
| Histopaque | Sigma-Aldrich | 10771 | FACS analysis |
| Ethyl alcohol anhydrous 99.5 % | Daejung | 4022-4110 | Disinfectant |
| Equipments | |||
| FineCycler C100 (Thermocycler) | Ssufine | – | Anealing |
| Centrifuge | Centrifuge | ||
| FACS tube | FALCON | 2052 | FACS analysis |
| Automated High-performance Flow Cytometer | BD (USA), FACSVerse | – | FACS analysis |
References
- Park, H. . Preparation of dodecynyl modified DNA nanoparticles with unmethylated CpG adjuvant and ovalbumin for immunostimulation. , (2016).
- Jin, J. O., Park, H., Zhang, W., de Vries, J. W., Gruszka, A., Lee, M. W., Ahn, D. R., Herrmann, A., Kwak, M. Modular delivery of CpG-incorporated lipid-DNA nanoparticles for spleen DC activation. Biomaterials. 115, 81-89 (2017).
- Pal, I., Ramsey, J. D. The role of the lymphatic system in vaccine trafficking and immune response. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (10-11), 909-922 (2011).
- Jin, J. O., Kwak, M., Xu, L., Kim, H., Lee, T. H., Kim, J. O., Liu, Q., Herrmann, A., Lee, P. C. W. Administration of soft matter lipid-DNA nanoparticle as the immunostimulant via multiple routes of injection in vivo. ACS Biomaterial Science & Engineering. 3 (9), 2054-2058 (2017).
- Worbs, T., Hammerschmidt, S. I., Förster, R. Dendritic cell migration in health and disease. Nature Review Immunology. 17 (1), 30-48 (2017).
- Milling, S. W. F., Jenkins, C., MacPherson, G. Collection of lymph-borne dendritic cells in the rat. Nature Protocols. 1 (5), 2263-2270 (2006).
- Desormeaux, A., Bergeron, M. G. Lymphoid tissue targeting of anti-HIV drugs using liposomes. Methods in Enzymology. 391, 330-351 (2005).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
- . . General anesthesia of mice and rats. , (2016).
- . . Guidelines for the Euthanasia of Animals. , (2013).
- . JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration I. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- . JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration III. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Review Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
