Effiziente Generation der Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Bauchspeicheldrüsen-Vorfahren aus hPSCs in Haftung Kulturen
Summary
Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Unterscheidung von menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs) in Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1+ (PDX1+) Zellen für die Erzeugung von Pankreas Linien auf Basis des-Kolonie Typ Monolage Wachstums der einzelne Zellen zu trennen. Diese Methode ist geeignet für die Herstellung von homogenen hPSC-abgeleitete Zellen, Genmanipulation und Überprüfung.
Abstract
Menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSC)-abgeleitete Zellen der Bauchspeicheldrüse sind eine vielversprechende Zelle Quelle für regenerative Medizin und als Plattform für menschliche Entwicklungsprozesse zu studieren. Stufenweise gerichtet, Differenzierung, die Entwicklungsprozesse rekapituliert ist einer der wichtigsten Wege, einschließlich Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1+ Zellen der Bauchspeicheldrüse zu generieren (PDX1+) Pankreas Vorläuferzellen. Konventionelle Protokolle initiieren die Differenzierung mit kleinen Kolonien kurz nach dem Durchgang. Jedoch in den Zustand der Kolonien oder Aggregate, Zellen sind anfällig für Heterogenitäten, die die Differenzierung zu PDX1 behindern könnte+ Zellen. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Unterscheidung von hPSCs in PDX1+ Zellen. Das Protokoll besteht aus vier Schritten und initiiert die Differenzierung nach Aussaat dissoziierten Einzelzellen. Die Induktion von SOX17+ endgültige Entoderm Zellen folgte der Ausdruck der beiden primitiven Darm Rohr Marker, HNF1β und HNF4α und eventuelle Differenzierung in PDX1+ Zellen. Dieses Protokoll bietet einfache Handhabung zu verbessern und stabilisieren die Differenzierung Effizienz einiger hPSC Zeilen, die bisher gefunden wurden, um ineffizient in endodermische Linien oder PDX1 zu unterscheiden+ Zellen.
Introduction
Die Bauchspeicheldrüse besteht hauptsächlich aus exokrinen und endokrinen Zellen, und seine Dysfunktion oder Überlastung verursacht mehrere Krankheiten wie Pankreatitis, Diabetes und Bauchspeicheldrüsenkrebs. Um die Pathogeny des Pancreatopathy zu erhellen, ist es notwendig, den Entwicklungsprozess und die Funktion von Zellen der Bauchspeicheldrüse zu analysieren. Darüber hinaus ist eine stabile Zelle Versorgung mit robuste Qualität herstellen Zellgewebe/Supplementierung Therapie erforderlich. Menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSC)-abgeleitete Zellen der Bauchspeicheldrüse sind eine vielversprechende Zelle Quelle für diese Zwecke, und die Differenzierung Protokoll gegen Zellen der Bauchspeicheldrüse wurde intensiv studierte1,2,3, 4. Die jüngsten Fortschritte bei der in-vitro-Erzeugung von pankreatischer β-Zellen imitieren die Generation der β-Zellen bei erwachsenen Menschen, und diese Zellen zeigen therapeutische Wirksamkeit bei der Implantation in diabetischen Modell Mäuse2,3. Darüber hinaus ergab die Analyse der β-Zellen von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) von gesunden und Typ 1 Diabetes Patienten Spender generiert keine funktionalen Unterschiede, auch wenn Sie unter Stress5. Darüber hinaus wurden Krankheit Phänotypen in induzierte Pankreaszellen mit Patienten abgeleitet iPSCs oder hPSCs beherbergen genetische Mutationen am gleichen Standort wie die Patienten6,7teilweise reproduziert.
Um Zellen der Bauchspeicheldrüse aus hPSCs erstellen, wird schrittweise gezielte Differenzierung, die Entwicklungsprozesse rekapituliert verwendet. Die Bauchspeicheldrüse leitet sich aus dem Entoderm Layer des frühen Embryos, die Geschlecht-Bestimmung von Region Y-Box 17 (SOX17) zum Ausdruck bringt und Forkhead Box A2 (FOXA2)8. Basierend auf den Studien an Mäusen, bildet die endodermische Schicht der primitiven Darm-Schlauch, der durch den Ausdruck der Hepatozyten nuklearer Faktor 1-Beta (Hnf1β) und Hepatozyten nuklearer Faktor 4-Alpha (Hnf4α) gekennzeichnet ist. Das primitive Darm Rohr verlängert und in die Atemwege Gerät, Verdauungstrakt und Organe entwickelt. Nach Dehnung, der hinteren Foregut Bereich wird der mutmaßlichen Pankreas Region, wie durch den Ausdruck der transcriptional Faktor Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1 (PDX1)8,9,10markiert. Die dorsalen und ventralen Teil der PDX1+ Darm Rohr verdicken, Form pankreatischen Knospen, die durch die Co Ausdruck der Bauchspeicheldrüse Transkription Faktor 1 Untereinheit Alpha (PTF1A) und NK6 Homeobox 1 (NKX6.1)8,11gekennzeichnet sind. Dieser Ausdruck beginnt morphologische der pankreatischen Organogenese. Pankreas Entoderm Zellen, die Komponenten der pankreatischen Knospen sind, bilden ein verzweigtes röhrenförmigen Netz von epithelialen Strukturen12 und schließlich in exokrinen und endokrinen Zellen, einschließlich der β-Zellen Insulin-sezernierenden differenzieren und Glukagon-sezernierenden α-Zellen. Ausdruck der PDX1 ist zunächst der mutmaßlichen Pankreas Region erkannt wird dann während der gesamten Bauchspeicheldrüse Entwicklung beobachtet und zeigt Lokalisierung zu β und δ-Zellen9,13,14. Obwohl die Pdx1+ Zelle Bereich, der nicht Ptf1a oder Nkx6.1 zum Ausdruck bringt unterscheidet in den Magen Antrum, Zwölffingerdarm, extrahepatische Gallenwege und einige Darmzellen bei mittleren bis späten Stadium der Entwicklung in Mäusen9PDX1+ Zellen gelten als Vorfahren der Bauchspeicheldrüse in der frühen Entwicklungsphase beim Menschen.
Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Unterscheidung von hPSCs in PDX1+ Zellen für die Erzeugung von Pankreas Abstammungen. Die Protokoll Eingeweihten Differenzierung durch impfen dissoziiert Einzelzellen15,16,17. Im Allgemeinen sind undifferenzierte hPSCs als Kolonien oder Zelle Aggregate in der Schwebe oder Adhäsion gepflegt. Infolgedessen initiieren die meisten Protokolle die Differenzierung kurz nach Passagierung Jedoch in den Zustand der Kolonien oder Aggregate, Zellen sind anfällig für räumliche und transkriptionelle Heterogenitäten18,19,20,21,,22, die behindern könnten die erster Differenzierung Schritt zur endgültigen Entoderm gefolgt von ineffizienten Differenzierung nach PDX1+ Zellen. Dieses Protokoll kann einfache Handhabung zur Verbesserung und Stabilisierung der Differenzierung Effizienz bieten einige hPSC-Linien, die bisher gefunden wurden, ineffizient, endodermische Linien und PDX1 unterscheiden+ Zellen23, 24 , 25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Generation der PDX1+ Zellen besteht aus mehreren Schritten; Daher ist es wichtig, Zellen zu gegebener Zeit zu behandeln. Unter den Schritten der Induktion Effizienz der endgültigen Entoderm wirkt sich weitgehend auf die endgültige Induktion Effizienz, möglicherweise durch Interferenzen von anderen kontaminierenden Abstammung-Zellen (d. h. Mesoderm und Ektoderm), die vermehren sich und/oder absondern können Faktoren, die die spezifische Differenzierung zu stören. Wenn der Anteil der SOX17+ Z…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde zum Teil unterstützt durch die Finanzierung der Japan Society für die Förderung von Science (JSPS) durch Scientific Research (C) (JSPS KAKENHI Grant Number15K09385 und 18 K 08510) t.t. und Beihilfe für JSPS Research Fellows (JSPS KAKENHI Grant-Nummer 17J07622), a.k., und die Japan-Agentur für medizinische Forschung und Entwicklung (AMED) durch seine Forschung gewähren “Core Center für iPS Zellforschung, Research Center-Netzwerk für die Realisierung der regenerativen Medizin” K.O. Die Autoren danken Dr. Peter Karagiannis für das Manuskript zu lesen.
Materials
| 3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine | Toronto Research Chemicals | K171000 | CYC |
| 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid | Santa Cruz Biotechnology | SC-203303 | TTNPB |
| 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y] | Abcam | Ab76541 | Anti-CDX2, × 1/1000 dilution |
| B-27 Supplement (50 ×) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | Serum-free supplement |
| BD FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | For flow cytometry | |
| Biomedical freezer | SANYO | MDF-U538 | For -30 °C storing |
| Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber | BIO-RAD | 1450011 | Counting slide glass |
| CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR | Greiner bio-one | 657165 | For differentiation culture/6-well plate |
| Centrifuge | TOMY | AX-310 | For cell culturing |
| Centrifuge | TOMY | MX-305 | For RT-qPCR |
| CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 | |
| CLEAN BENCH | SHOWA KAGAKU | S-1601PRV | Clean bench |
| Corning CellBIND 6-well plate | Corning | 3335 | For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| Corning Synthemax II-SC Substrate | Corning | 3535 | For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs |
| Cryostat | Leica | Leica CM1510 S | For immunostaining of aggregates. |
| Cytofix/Cytoperm Kit | Becton Dickinson | 554714 | Perm/Wash buffer is Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer. |
| Dako pen | Dako | S2002 | For immunostaining of aggregates |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18427-088 | For RT-qPCR |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey Serum | Merck Millipore | S30 | Donkey serum |
| D-PBS(-) without Ca or Mg | Nacalai tesque | 14249-95 | DPBS |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium |
| Falcon 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer |
| Filter Tip, 1000 µL | Watoson | 124-1000S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 20 µL | Watoson | 124-P20S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 200 µL | Watoson | 124-P200S | Use together with pipettes |
| Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | For immunostaining |
| Forma Steri-Cycle CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370A | Incubator |
| HNF-1β Antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7411 | Anti-HNF1β, × 1/200 dilution |
| HNF-4α Antibody (H-171) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8987 | Anti-HNF4α, × 1/200 dilution |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | For nucleus staining, × 1/200 dilution |
| Human Pancreas Total RNA | Ambion | AM7954 | For RT-qPCR |
| Human PDX-1/IPF1 Antibody | R&D Systems | AF2419 | Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 dilution |
| Human SOX17 Antibody | R&D Systems | AF1924 | Anti-SOX17, × 1/200 dilution |
| Improved MEM Zinc Option medium | Thermo Fisher Scientific | 10373-017 | iMEM |
| Incubation chamber | Cosmo Bio | 10DO | For immunostaining of aggregates |
| Latex Examination Gloves | Adachi | ||
| MAS coated slide glass | Matsunami Glass | 83-1881 | For immunostaining of aggregates |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | 4346907 | For RT-qPCR |
| Microscope | Olympus | CKX41N-31PHP | For cell culturing |
| Microtube | Watoson | 131-515CS | |
| Monoclonal Anti-α-Fetoprotein | SIGMA | A8452 | Anti-AFP, × 1/200 dilution |
| Nanodeop 8000 | Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Oligo dT | FASMAC | Custom made Oligo | For RT-qPCR of sequence is "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT" |
| Paraformaldehyde, powder | Nacalai tesque | 26126-54 | PFA, fixative, diluted in DPBS |
| Pharmaceutical refrigerator | SANYO | MPR-514 | For 4 °C storing |
| PIPETMAN P | GILSON | Pipette | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 | R&D Systems | 251-KG | KGF |
| Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | NOGGIN |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A | R&D Systems | 338-AC | Activin A |
| ReverTra Ace (100 U/μL) | TOYOBO | TRT-101 | For RT-qPCR |
| Rnase-Free Dnase Set (50) | QIAGEN | 79254 | For RT-qPCR |
| Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | For RT-qPCR |
| RPMI 1640 with L-Gln | Nacalai tesque | 30264-85 | RPMI 1640 |
| Sealing Film for Real Time | Takara | NJ500 | For RT-qPCR |
| Serological pipettes 10 mL | Costar/Corning | 4488 | For cell culturing |
| Serological pipettes 25 mL | Costar/Corning | 4489 | For cell culturing |
| Serological pipettes 5 mL | Costar/Corning | 4487 | For cell culturing |
| Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb | Cell signaling | 3579S | Anti-SOX2, × 1/200 dilution |
| StepOnePlus | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Sucrose | Nacalai tesque | 30406-25 | For immunostaining of aggregates |
| TB Green Premix Ex Taq II |
Takara | RR820B | For RT-qPCR |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450101J1 | Automatic cell counter |
| Tissue-Tek OCT compound 4583 | Sakura Finetechnical | 4583 | For immunostaining of aggregates |
| Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters | Sakura Finetechnical | 4566 | For immunostaining of aggregates |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Trypan Blue | BIO-RAD | 1450021 | |
| Ultracold freezer | SANYO | MDF-U33V | For -80 °C storing |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Y-27632 | Wako | 251-00514 |
References
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