Effektiv generering av bukspottkörteln/tolvfingertarmen Homeobox Protein 1+ bakre framtarmen/pankreas stamfäder från hPSCs i vidhäftning kulturer
Summary
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att skilja mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs) i bukspottkörteln/tolvfingertarmen homeobox protein 1+ (PDX1+) celler för generering av bukspottskörteln härstamningar baserat på icke-koloni typ enskiktslager tillväxten av dissocierade enstaka celler. Denna metod är lämplig för att producera homogen hPSC-derived celler, genmanipulation och screening.
Abstract
Mänskliga pluripotenta stamceller (hPSC)-härledda bukspottkörtelns celler är en lovande cell källa för regenerativ medicin och en plattform att studera mänskliga utvecklingsprocesser. Stegvis riktas differentiering som recapitulates utvecklingsprocesser är ett av de viktigaste sätten att generera bukspottkörtelns celler inklusive bukspottkörteln/tolvfingertarmen homeobox protein 1+ (PDX1+) bukspottskörteln stamceller. Konventionella protokoll initiera differentiering med små kolonier strax efter passage. Dock i tillståndet i kolonier eller aggregat, celler är benägna att heterogeneitiesna, vilket kan hämma differentieringen till PDX1+ celler. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att skilja hPSCs in PDX1+ celler. Protokollet består av fyra steg och initierar differentieringen av sådd dissocierade enstaka celler. Induktion av SOX17+ slutgiltiga endoderm celler följdes av uttrycket av två primitiva gut tube markörer, HNF1β och HNF4α och eventuell differentiering in PDX1+ celler. Detta protokoll ger enkel hantering och kan förbättra och stabilisera differentiering effektiviteten i vissa hPSC linjer som tidigare hittades differentieras ineffektivt till endodermal härstamningar eller PDX1+ celler.
Introduction
Bukspottkörteln består huvudsakligen av exokrina och endokrina celler, och dess dysfunktion eller överbelastning orsakar flera sjukdomar, såsom pankreatit, diabetes och cancer i bukspottskörteln. För att belysa pathogeny av pancreatopathy, är det nödvändigt att analysera den utvecklingsprocess och funktion av bukspottkörtelns celler. Dessutom krävs en stabil cell leverans med robust kvalitet att upprätta cell/vävnad tillskott terapi. Mänskliga pluripotenta stamceller (hPSC)-härledda bukspottkörtelns celler är en lovande cell källa för dessa ändamål, och protokollet differentiering mot bukspottkörtelns celler har varit intensivt studerade1,2,3, 4. Senaste framstegen inom in vitro-produktion av pankreas β-celler härma generationen av β-celler i vuxen människa, och dessa celler Visa terapeutisk effekt vid implantering i diabetiker modell möss2,3. Dessutom visade analysen av β-celler som genereras från de inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) av friska och typ 1 diabetes patienten givare inga funktionella skillnader inklusive när under stress5. Dessutom har sjukdomen fenotyper återgivits delvis i inducerade bukspottkörtelns celler med patientderiverade iPSCs eller hPSCs härbärgerat genetiska mutationer i samma plats som patienter6,7.
För att generera bukspottkörtelns celler från hPSCs, används stegvis riktad differentiering som recapitulates utvecklingsprocesser. Bukspottkörteln härleds från endoderm lagret av det tidiga embryot, som uttrycker kön bestämma region Y-box 17 (SOX17) och forkhead box A2 (FOXA2)8. Baserat på studier som mus, bildar endodermal lagret primitiva gut röret, som präglas av uttrycket av hepatocyte nukleär faktor 1-beta (Hnf1β) och hepatocyte nukleär faktor 4-alpha (Hnf4α). Primitiva gut röret förlänger och utvecklas till den respiratoriska apparater, mag-tarmkanalen och organ. Efter töjning, blir området bakre framtarmen presumtiv bukspottskörteln regionen, som märkt av uttrycket av transkriptionell faktor bukspottkörteln/tolvfingertarmen homeobox protein 1 (PDX1)8,9,10. De dorsala och ventrala delarna av PDX1+ gut tube tjockna till formuläret bukspottskörteln knoppar, som är märkta med samtidig uttryck för bukspottkörteln transkription faktorn 1 subenhet alpha (PTF1A) och NK6 homeobox 1 (NKX6.1)8,11. Detta uttryck inleds morfologiska bukspottskörteln organogenesen. Bukspottskörteln endoderm celler, vilka är komponenterna i bukspottskörteln knopparna, bildar en förgrenad tubulär nätverk av epiteliala strukturer12 och så småningom differentieras till exokrina och endokrina celler, inklusive insulin-utsöndrar β-celler och glukagon utsöndrar α-cellerna. Uttryck för PDX1 upptäcks först vid presumtiva bukspottskörteln regionen, som är sedan firas under hela bukspottskörteln utveckling, och visar lokalisering till β – och δ-celler9,13,14. Även om Pdx1+ cellområde som inte uttrycker Ptf1a eller Nkx6.1 gör åtskillnad mellan in i den gastric antrum, tolvfingertarmen, extrahepatiska gallvägar och vissa intestinala celler på mitten till sent skede av utveckling i möss9, PDX1+ celler anses föräldraparets i bukspottkörteln på tidiga utvecklingsstadiet hos människor.
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att skilja hPSCs in PDX1+ celler för generering av bukspottskörteln härstamningar. Protokoll initierar differentieringen av sådd separerade enstaka celler15,16,17. I allmänhet hanteras odifferentierade hPSCs som kolonier eller cell aggregat i suspension eller vidhäftning. Som ett resultat, initiera de flesta protokoll differentiering strax efter passaging. Dock i tillståndet i kolonier eller aggregat, celler är benägna att rumsliga och transkriptionell heterogeneitiesna18,19,20,21,22, som kan hindra den första differentiering steg mot slutgiltiga endoderm följt av ineffektiva differentiering till PDX1+ celler. Detta protokoll kan erbjuda enkel hantering för att förbättra och stabilisera differentiering effektiviteten av vissa hPSC linjer som fanns tidigare för att skilja ineffektivt endodermal härstamningar och PDX1+ celler23, 24 , 25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Generering av PDX1+ celler består av flera steg; Därför är det viktigt att behandla celler vid lämplig tidpunkt. Bland stegen, slutgiltiga endoderm induktion effektivitet i hög grad påverkar den slutliga induktion effektiviteten, möjligen av störningar från andra kontaminerande härstamning celler (dvs, mesoderm och ektoderm), som kan föröka sig eller utsöndrar faktorer som störa viss differentiering. Om andelen SOX17+ celler är lägre än 80% på dag 4 (etapp 1B), en effektiv indukti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds delvis av finansiering från Japan Society för främjande av vetenskap (JSPS) genom Scientific Research (C) (JSPS KAKENHI Grant Number15K09385 och 18 K 08510) till T.T. och bidrag för JSPS Research Fellows (JSPS KAKENHI-licensnummer 17J07622) Arvidsson, och Japan läkemedelsmyndigheten för medicinsk forskning och utveckling (AMED) genom dess forskning bevilja ”Core Center för iPS cellforskning, Research Center nätverk för förverkligandet av regenerativ medicin” till K.O. Författarna vill tacka Dr Peter Karagiannis för att läsa manuskriptet.
Materials
| 3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine | Toronto Research Chemicals | K171000 | CYC |
| 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid | Santa Cruz Biotechnology | SC-203303 | TTNPB |
| 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y] | Abcam | Ab76541 | Anti-CDX2, × 1/1000 dilution |
| B-27 Supplement (50 ×) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | Serum-free supplement |
| BD FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | For flow cytometry | |
| Biomedical freezer | SANYO | MDF-U538 | For -30 °C storing |
| Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber | BIO-RAD | 1450011 | Counting slide glass |
| CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR | Greiner bio-one | 657165 | For differentiation culture/6-well plate |
| Centrifuge | TOMY | AX-310 | For cell culturing |
| Centrifuge | TOMY | MX-305 | For RT-qPCR |
| CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 | |
| CLEAN BENCH | SHOWA KAGAKU | S-1601PRV | Clean bench |
| Corning CellBIND 6-well plate | Corning | 3335 | For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| Corning Synthemax II-SC Substrate | Corning | 3535 | For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs |
| Cryostat | Leica | Leica CM1510 S | For immunostaining of aggregates. |
| Cytofix/Cytoperm Kit | Becton Dickinson | 554714 | Perm/Wash buffer is Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer. |
| Dako pen | Dako | S2002 | For immunostaining of aggregates |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18427-088 | For RT-qPCR |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey Serum | Merck Millipore | S30 | Donkey serum |
| D-PBS(-) without Ca or Mg | Nacalai tesque | 14249-95 | DPBS |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium |
| Falcon 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer |
| Filter Tip, 1000 µL | Watoson | 124-1000S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 20 µL | Watoson | 124-P20S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 200 µL | Watoson | 124-P200S | Use together with pipettes |
| Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | For immunostaining |
| Forma Steri-Cycle CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370A | Incubator |
| HNF-1β Antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7411 | Anti-HNF1β, × 1/200 dilution |
| HNF-4α Antibody (H-171) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8987 | Anti-HNF4α, × 1/200 dilution |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | For nucleus staining, × 1/200 dilution |
| Human Pancreas Total RNA | Ambion | AM7954 | For RT-qPCR |
| Human PDX-1/IPF1 Antibody | R&D Systems | AF2419 | Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 dilution |
| Human SOX17 Antibody | R&D Systems | AF1924 | Anti-SOX17, × 1/200 dilution |
| Improved MEM Zinc Option medium | Thermo Fisher Scientific | 10373-017 | iMEM |
| Incubation chamber | Cosmo Bio | 10DO | For immunostaining of aggregates |
| Latex Examination Gloves | Adachi | ||
| MAS coated slide glass | Matsunami Glass | 83-1881 | For immunostaining of aggregates |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | 4346907 | For RT-qPCR |
| Microscope | Olympus | CKX41N-31PHP | For cell culturing |
| Microtube | Watoson | 131-515CS | |
| Monoclonal Anti-α-Fetoprotein | SIGMA | A8452 | Anti-AFP, × 1/200 dilution |
| Nanodeop 8000 | Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Oligo dT | FASMAC | Custom made Oligo | For RT-qPCR of sequence is "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT" |
| Paraformaldehyde, powder | Nacalai tesque | 26126-54 | PFA, fixative, diluted in DPBS |
| Pharmaceutical refrigerator | SANYO | MPR-514 | For 4 °C storing |
| PIPETMAN P | GILSON | Pipette | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 | R&D Systems | 251-KG | KGF |
| Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | NOGGIN |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A | R&D Systems | 338-AC | Activin A |
| ReverTra Ace (100 U/μL) | TOYOBO | TRT-101 | For RT-qPCR |
| Rnase-Free Dnase Set (50) | QIAGEN | 79254 | For RT-qPCR |
| Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | For RT-qPCR |
| RPMI 1640 with L-Gln | Nacalai tesque | 30264-85 | RPMI 1640 |
| Sealing Film for Real Time | Takara | NJ500 | For RT-qPCR |
| Serological pipettes 10 mL | Costar/Corning | 4488 | For cell culturing |
| Serological pipettes 25 mL | Costar/Corning | 4489 | For cell culturing |
| Serological pipettes 5 mL | Costar/Corning | 4487 | For cell culturing |
| Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb | Cell signaling | 3579S | Anti-SOX2, × 1/200 dilution |
| StepOnePlus | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Sucrose | Nacalai tesque | 30406-25 | For immunostaining of aggregates |
| TB Green Premix Ex Taq II |
Takara | RR820B | For RT-qPCR |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450101J1 | Automatic cell counter |
| Tissue-Tek OCT compound 4583 | Sakura Finetechnical | 4583 | For immunostaining of aggregates |
| Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters | Sakura Finetechnical | 4566 | For immunostaining of aggregates |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Trypan Blue | BIO-RAD | 1450021 | |
| Ultracold freezer | SANYO | MDF-U33V | For -80 °C storing |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Y-27632 | Wako | 251-00514 |
References
- D’Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Kondo, Y., Toyoda, T., Inagaki, N., Osafune, K. iPSC technology-based regenerative therapy for diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 9 (2), 234-243 (2017).
- Millman, J. R., et al. Generation of stem cell-derived beta-cells from patients with type 1 diabetes. Nature Communications. 7, 11463 (2016).
- Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
- Hosokawa, Y., et al. Insulin-producing cells derived from ‘induced pluripotent stem cells’ of patients with fulminant type 1 diabetes: Vulnerability to cytokine insults and increased expression of apoptosis-related genes. Journal of Diabetes Investigation. , (2017).
- Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
- Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
- Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
- Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
- Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
- Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochemical Journal. 310 (Pt 3), 997-1003 (1995).
- Riedel, M. J., et al. Immunohistochemical characterisation of cells co-producing insulin and glucagon in the developing human pancreas. Diabetologia. 55 (2), 372-381 (2012).
- Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
- Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
- Toyoda, T., et al. Rho-Associated Kinases and Non-muscle Myosin IIs Inhibit the Differentiation of Human iPSCs to Pancreatic Endoderm. Stem Cell Reports. 9 (2), 419-428 (2017).
- Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Nguyen, Q. H., et al. Single-cell RNA-seq of human induced pluripotent stem cells reveals cellular heterogeneity and cell state transitions between subpopulations. Genome Research. 28 (7), 1053-1066 (2018).
- Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121 (3), 1217-1221 (2011).
- Rosowski, K. A., Mertz, A. F., Norcross, S., Dufresne, E. R., Horsley, V. Edges of human embryonic stem cell colonies display distinct mechanical properties and differentiation potential. Scientific Reports. 5, 14218 (2015).
- Torres-Padilla, M. E., Chambers, I. Transcription factor heterogeneity in pluripotent stem cells: a stochastic advantage. Development. 141 (11), 2173-2181 (2014).
- Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 14 (6), 357-368 (2013).
- Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
- Kimura, A., et al. Small molecule AT7867 proliferates PDX1-expressing pancreatic progenitor cells derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 24, 61-68 (2017).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).
- Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), (2015).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 109 (31), 12538-12543 (2012).
- Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson’s disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
- Suemori, H., et al. Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage. Biochemical and Biophysical Research Communication. 345 (3), 926-932 (2006).
- Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), e82076 (2013).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
- Kelly, O. G., et al. Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 29 (8), 750-756 (2011).
- Hohwieler, M., et al. Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling. Gut. 66 (3), 473-486 (2017).
- Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture. Scientific Reports. 4, 4488 (2014).
