Summary
Här beskriver vi ett protokoll för att undersöka prenylation och guanosin-5'-trifosfat (GTP)-lastning av Rho GTPase. Detta protokoll består av två detaljerade metoder, nämligen membran fraktionering och en GTPase-linked immunosorbent assay. Protokollet kan användas för att mäta prenylation och GTP lastning av olika andra små GTPases.
Abstract
Familjen Rho GTPase tillhör överfamiljen Ras och omfattar ca 20 medlemmar i människor. Rho GTPases är viktiga i regleringen av olika cellulära funktioner, såsom cytoskeletal dynamics, cell motilitet, cell polaritet, axonal vägledning, vesikulär människohandel och cellcykeln kontroll. Förändringar i Rho GTPase signalering spelar en viktig reglerande roll i många sjukdomstillstånd, såsom cancer, sjukdomar i centrala nervsystemet och immunförsvaret-beroende sjukdomar. Posttranslationell modifiering av Rho GTPases (dvs., prenylation av mevalonate väg intermediärer) och GTP bindande är viktiga faktorer som påverkar aktiveringen av detta protein. I detta papper finns två grundläggande och enkla metoder för att upptäcka ett brett utbud av Rho GTPase prenylation och GTP bindande aktiviteter. Uppgifter om de tekniska förfaranden som har använts förklaras steg för steg i detta manuskript.
Introduction
Rho GTPases är en grupp av små proteiner (21-25 kDa), som är väl bevarad i hela evolution, och bildar en unik underfamilj i Ras överfamiljen av små GTPases. I varje underfamilj inom denna superfamiljen finns det en delade G domän kärna som är inblandad i GTPase aktivitet och nukleotid exchange1. Skillnaden mellan familjen Rho och de andra Ras underfamiljerna är förekomsten av en ”Rho infoga domän” inom den 5: e β strand och 4th α helix i små GTPase domän2.
Baserat på den senaste klassificeringen, anses Rho GTPases en familj av proteiner som passar in i de Ras GTPase superfamiljen3-signalering. Däggdjur Rho GTPases har 22 medlemmar baserat på deras specifika funktion och allmän karakterisering4 där RhoA, Rac1 och Cdc42 är bland de mer studerade medlemmarna i denna grupp. Rho GTPases är kopplade till Intracellulär signalering vägar via en hårt reglerad mekanism som är beroende av molekylär växlar via protein posttranslationell ändringar5.
GTP lastning och hydrolys är grundläggande mekanismer i cykelns aktivering/avaktivering av små Rho GTPases och är reglerad via GTPase-aktiverande protein (luckor). Luckor är ansvarig för den GTP hydrolysisen och arbeta i samförstånd med guanin nukleotid exchange faktorer (GEFs) som är ansvariga för GTP-lastning reaktionen. Rho BNP dissociation hämmare (GDIs) ge ytterligare reglering av små Rho GTPases via bindning till den BNP-bundna Rho GTPases. Detta hämmar BNP dissociation och underlättar komplexbildare av små Rho GTPases bort från de aktiva intracellulära membran platserna. Det finns också ytterligare reglering av Rho GTPase proteiner som innefattar de prenylation för GDIs som reglerar både nukleotid hydrolys och exchange och kontroller BNP/GTP cykling1,6,7,8.
Både GTP-lastning och Rho GTPase prenylation är involverade i rörelsen av Rho GTPase mellan cytosol och cellmembran genom att ändra dessa proteiner1,9lipofila egenskaper. Ovannämnda tillsynsmyndigheterna interagera med fosfolipider i cellmembranet och andra modulerande proteiner av BNP/GTP exchange aktivitet10. Dessutom blockerar GDIs, dissociation-hämmare, både den GTP hydrolysisen och BNP/GTP utbyte. GDIs hämmar dissociationen av de inaktiva Rho proteinerna från BNP och därmed deras interaktion med nedströms effektorer. GDIs reglerar också cyklingen av GTPases mellan cytosol och membranet i cellen. Aktiviteten av Rho GTPases beror till stor del på deras rörelse till cellmembranet; således anses GDIs kritiska regulatorer som kan binda GTPases i cytoplasman genom gömmer sin hydrofoba region/domäner11,12.
För Rho GTPase att ha en optimal signalering och funktion i alla stadier av dess aktivering cykel, är dynamisk cykeln av GTP-lastning/GTP hydrolysis avgörande. Någon form av förändringar i denna process kan leda till ändringar i cellfunktioner regleras av Rho GTPase, såsom cell polaritet, spridning, morfogenes, cytokines, migration, vidhäftning och överlevnad13,14.
Det nuvarande protokollet ger läsarna en detaljerad metod för att övervaka små RhoA GTPase aktiveringen via utredning av deras prenylation och BNP/GTP lastning. Denna metod kan också användas för att upptäcka prenylation och GTP bindningen av ett brett utbud av små GTPases. Den GTPase-linked immunosorbent assay kan användas för att mäta graden av aktivering av andra sorter av GTPases, såsom Rac1, Rac2, Rac3, H-, K- eller N-Ras, Arf och Rho15. Den farmakologiska agent simvastatin används som ett exempel, eftersom det var nyligen rapporterat att vara inblandade i regleringen av små Rho GTPase prenylation och aktivitet8,9,14,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bestämning av RhoA lokalisering med membran/Cytosol fraktionering
-
Cell kultur och simvastatin behandling
- Utsäde 50.000 av U251 celler i ett 100 mm skålen och kultur dem i Dulbecco's modified örnens medium (DMEM) (hög glukos, 10% fetalt bovint serum [FBS]).
- När 30% konfluenta, behandla cellerna genom att ta bort mediet och lägga till simvastatin-innehållande medium det (10 µM simvastatin upplöst i dimetyl sulfoxid [DMSO]) och Inkubera under 36 timmar vid 37 ° C8. Använda DMSO ensam som en kontroll av fordon.
Obs: 10 miljoner celler behövs för den cytosol och membran fraktioneringen av cellerna.
-
Samling av celler
- Ta bort celler från 37 ° C inkubatorn. Titta på celler i Mikroskop för att bekräfta konfluens.
Obs: Cellerna bör vara 70-80% konfluenta. - Aspirera medium, tvätta cellerna 1 x med kall fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Tillsätt 5 mL av etylendiamintetraättiksyra (EDTA) syra buffert (KCl: 400 mg/L, NaCl: 6800 mg/L, NaHCO3: 2200 mg/L, NaH2PO4. H2O: 140 mg/L, D-glukos: 1000 mg, dinatrium EDTA: 373 mg/L) per platta och plats cellerna tillbaka till 37 ° C inkubatorn för 5 min.
- Efter 5 min inkubering, samla EDTA med cellerna i en 15 mL tub som innehåller samma mängd av medium som EDTA.
Obs: Att ha medium i röret neutraliserar EDTA och förhindrar eventuella ytterligare nedbrytning av cellmembranen. - Placera röret i en ice box och vidare till centrifugen.
- Ställ in centrifugen-1,500 x g vid 4 ° C och snurra cellerna för 5 min.
- Ta bort supernatanten utan att störa pelleten och tillsätt 1 mL kall PBS. Blanda cellerna väl.
- Överföra cell blandningen (lösning) till en ny 1,5 mL tub, Centrifugera vid 1500 x g vid 4 ° C, och snurra cellerna för 5 min.
- Kontrollera pelleten storleken (för att uppskatta volymen av bufferten för nästa steg). Placera proverna på is. Kassera supernatanten helt utan att störa pelleten.
- Lägg till iskall buffert jag (10 mM Tris-HCl [pH 7,5], 0,1 mM EDTA, 0,1 mM EGTA, 1 mM Ditiotreitol och proteashämmare cocktail), Blanda proverna väl genom pipettering upp och ner, och fortsätt sedan till ultraljudsbehandling.
- Ta bort celler från 37 ° C inkubatorn. Titta på celler i Mikroskop för att bekräfta konfluens.
-
Ultraljudsbehandling
- Ange den någon sonikator för fem cykler, 5 s varje, och upprepa 3 x.
- Utföra ultraljudsbehandling på is. Gå vidare till ultracentrifugen.
Obs: Is och kallt tillstånd bevara proteinerna och göra resultaten mer tillförlitliga.
-
Ultracentrifugering
- Använd en ultracentrifugen för att separera den cellen homogenates i cytoplasmiska och membran fraktioner. Ange centrifugen till 100 000 x g under 35 minuter vid 4 ° C. Som visas i figur 1, kontrollera pelleten storleken.
Obs: Den membran-fraktionen är på botten av röret och resten är andra cytoplasmiska komponenter. - Samla in supernatanten helt och var noga med att inte störa pelleten. Supernatanten är den cytosoliska fraktionen. Placera supernatanten i ett nyligen märkta rör.
- Tillsätt 300 µL av dissociation buffert (buffert II) (50 mM Tris-HCl [pH 7,5], 0,15 M NaCl, 1 mM Ditiotreitol, 1% SDS, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA och proteashämmare cocktail) att pelleten (innehåller den membran-fraktionen). Blanda väl genom pipettering upp och ner.
- Gå vidare till protein beslutsamhet och western blot (immunoblot analys) provberedning.
- Använd en ultracentrifugen för att separera den cellen homogenates i cytoplasmiska och membran fraktioner. Ange centrifugen till 100 000 x g under 35 minuter vid 4 ° C. Som visas i figur 1, kontrollera pelleten storleken.
-
Immunoblotting
- Förbereda proteinet cell extrakt från de avskilda fraktionerna i lyseringsbuffert (20 mM Tris-HCl [pH 7,5], 0,5 mM PMSF, 0,5% icke-joniskt rengöringsmedel-40, 100 µM β-glycerol 3-fosfat, och 0,5% proteashämmare cocktail).
- Mätning av protein koncentrationen med den Lowry metod8 och beräkna volymen av lyseringsbuffert (20 mM Tris-HCl [pH 7,5], 0,5 mM PMSF, 0,5% nondenaturing rengöringsmedel, octylphenoxypolyethoxyethanol, 100 µM β-glycerol 3-fosfat och 0,5% Proteas hämmare cocktail) att normalisera koncentrationen av protein mellan proverna.
- Värm proverna vid 90 ° C i 5 min och ladda 15-20 µL av proverna på en 15% SDS-PAGE gel att separera proteiner.
Lägg 1 µg av protein för varje prov. Beräkna volymen som behöver köras med detta. - Överföra de separerade proteinerna till nylon membran under minska villkor (500 nM glycin, 50 mM Tris-HCl och 20% metanol) för 2 h, vid rumstemperatur (RT) vid 100 V.
Obs: För att bekräfta lyckad protein överföringen, Använd Ponceau fläcken eller visualisera protein markören på membranet. - Blockera membran med 5% fettfri torrmjölk och 1 x Tris-buffrad koksaltlösning innehållande tvättmedel (TBS/0.01% Nonjonaktivt rengöringsmedel; TBST) att blockera ospecifik antikropp bindande vid 4 ° C över natten eller RT för 1 h.
- Lägg till primära antikroppar för immunoblotting analys och inkubera över natten vid 4 ° C.
Obs: I detta experiment, Rac1/2/3, cdc42, RhoA, GAPDH och pan-Cadherin användes vid en 1:1,000 spädning i 1% mjölk i 1 x TBST. Pan-Cadherin och GAPDH användes att bekräfta membran och cytosoliska bråkdel renhet, respektive. - Tvätta membranen 3 x med en tvätt buffert med 1 x TBST i 20 min.
- Inkubera membran med anti-kanin pepparrotsperoxidas (HRP)-konjugerad sekundär antikropp för respektive primära antikropparna (för 1 h på RT).
- Tvätta blopparna 3 x 20 minuter och utveckla dem med förbättrad chemiluminescence (ECL) upptäckt.
2. mätning av RhoA GTP lasten med en liten G-protein aktivering-analys
- Räkna 10 000 celler/mL och kultur U251 cellerna i ett 100 mm fat.
- När de är 30% konfluenta, behandla cellerna med simvastatin som beskrivs i steg 1.1.2.
- Föra kultur plattorna ur inkubatorn. Titta på celler i Mikroskop till bekräfta konfluens. Säkerställa att cellerna är 70-80% konfluenta. Placera petriskål på is, aspirera media och tvätta cellerna 3 x med iskall PBS (pH 7,2).
- Aspirera PBS. Tilt petriskål på is för en extra minut för att ta bort alla rester av PBS.
Obs: Kvarstående PBS negativt påverkar denna analys. - Lysera celler i en 700 µL volym iskall lyseringsbuffert innehållande proteashämmare och fosfatas-hämmare.
Obs: 700 µL är oftast tillräckligt för en 100 mm petriskål. Se tabell 1 för att hitta rätt volym för varje fartyg som kultur. - Skörda cellen lysate med cell skrapan. Incline kultur plattan för denna teknik.
- Överföra den lysate till en märkt iskalla cryotube och hålla den på is.
- Blanda ordentligt med en virvel. Håll 10 µL av den lysate för protein analysen, att mäta protein koncentrationen i provet.
- Snapin-frysa den återstående cellen lysate i flytande kväve.
Obs: Laga flera portioner av cell lysate innan snapin-frysa dem, för att undvika upprepad frysning/tining cykler som kan leda till förlust av aktivitet av RhoA GTPase. - Överföra den snapin-fryst frysrör till-80 ° C frys och lagra proverna för den GTPase-linked immunosorbent assay.
Obs: Förvara inte proverna för längre än 14 dagar. Arbeta snabbt och aldrig lämna proverna på isen längre än 10 min. Hantera aldrig alla petriskålar samtidigt. - Mätning av protein koncentrationen med den Lowry metod8 och beräkna volymen av den lyseringsbuffert att normalisera koncentrationen av protein mellan proverna.
Obs: Den bästa koncentrationen är oftast 1 mg/mL; dock 0,3 - 2 mg/mL kan upptäckas. - Förbereda ett blankprov genom att lägga 60 µL lyseringsbuffert och 60 µL av bindande buffert till ett mikrorör.
Obs: Blankprovet har alla reagens utom antigenet och används för subtraktionen av bakgrunden. - Förbereda en positiv kontroll genom att lägga till 12 µL av Rho kontroll protein, 48 µL lyseringsbuffert och 60 µL av bindande buffert.
Obs: Den positiva kontrollen har alla reagenser plus en bekräftad antigen för Rho-A-GTP. - Ta Rho affinitet plattan ur sin väska och placera den på is.
- Lös upp pulvret i brunnarna med 100 µL av iskallt destillerat vatten. Hålla plattan på is.
- Tina den snapin-fryst cellen lysates i vattenbad inställt på 25 ° C.
- Lägg till den beräknade volymen iskall lyseringsbuffert (från steg 2.11) till varje prov att normalisera proteinkoncentration.
Obs: Ta bort PBS efter tvättning cellerna (med ett vakuumrör hygienfilter) för att undvika orsakar förändringar i sammansättningen av lyseringsbuffert. Utjämna prov proteinet till en koncentration mellan 0,8 och 2 mg/mL för en korrekt jämförelse mellan prover i GTPase aktiveringen analyser. Tabell 2 ger information om bufferten ska användas för denna analys. - Överföra 60 µL av de normaliserade iskalla proverna till mikrorör och tillsätt 60 µL av bindande buffert; Blanda proverna och hålla dem på isen.
- Helt ta bort de vatten/lösningarna från mikroplattan genom kraftig snärta, följt av fem till sju hårt kranar på en lab-matta.
- Tillsätt 50 µL normaliserade proverna, ett blankprov och en positiv kontroll i brunnarna i dubbletter.
- Placera plattan i orbitalskak under 30 minuter vid 4 ° C vid 300 rpm.
Obs: Det skakande steget är mycket viktigt, och det är rekommenderat att använda orbital plattan shaker vid 300 rpm. - Rensa proverna från plattan genom att snärta och tvätta dem 2 x med 200 µL tvätt buffert på RT. kraftfullt bort tvätt bufferten från brunnarna efter varje tvätt genom att snärta, följt av avlyssning, och hålla plattan på bänken på RT.
- Tillsätt 200 µL RT antigen-presenterande buffert i varje brunn och inkubera vid RT i 2 min.
- Häll ut lösningen från brunnarna och Tvätta brunnarna 3 x med 200 µL tvätt buffert på RT.
- Tillsätt 50 µL av nylagade 1/250 anti-RhoA primär antikropp till varje brunn.
- Placera plattan i orbitalskak för 45 min vid 300 rpm inställd på 25 ° C. Häll ut lösningen från brunnen.
- Upprepa stegen tvätt 2 x (steg 2.24).
- Tillsätt 50 µL av nylagade 1/250 anti-RhoA sekundär antikropp till varje brunn.
- Placera plattan ovanpå orbitalskak för 45 min vid 300 rpm inställd på 25 ° C.
- Förbered HRP upptäckt reagens genom att blanda lika stora volymer av reagens A och reagens B.
- Häll ut lösningen från varje brunn och Tvätta brunnarna 3 x med 200 µL tvätt buffert på RT.
- Tillsätt 50 µL av nylagade HRP upptäckt reagens till varje brunn.
- Läs självlysande signalen inom 3-5 min att få maximal signalen och analysera resultatet med hjälp av en lämplig programvarupaket.
Obs: Avläsningar måste göras inom 3-5 min att få maximal signalen. Kör en ”test plattan” bekräfta korrekt Lys buffert volymen används för den cellen lysates så att protein koncentrationen är tillräckligt hög för att upptäcka RhoA GTPase aktivitet. (Ett test-plattan är en platta av celler som används för att bestämma om protein koncentrationen faller inom det godkända intervallet och också att avgöra om volymen av den lyseringsbuffert som används är lämpliga.) Den positiva kontrollen bör läsa 4 - 10 gånger högre än de tomma brunnarna om det är i det linjära området. Om inte, justera sedan luminometern genom samråd med tillverkaren. Inställningarna för luminometern ges i tabell 3. - Ange rådata i kolumner där rubrikerna läsa prov, menar, Standardavvikelse, rep1, rep2, rep3och rep4, som är att visa antalet replikat görs på varje prov.
- Ange den formeln =average(Xn:Yn) under menar, där X = den kolumnen beteckningen för rep1, Y = den kolumnen beteckningen för rep4, och n = den rad beteckningen för den rad som arbetas på.
- Ange formeln = STDAV (Xn:Yn) under standardavvikelsen, där X = den kolumnen beteckningen för rep1, Y = den kolumnen beteckningen för rep4, och n = den rad beteckningen för den rad som arbetas på.
- Ange replikerar data i rep1, rep2o.s.v.
- Efter att data, använder du metoden Klicka-och-dra för att välja prov, menaroch standardavvikelsen.
- Välj funktionen för diagram att göra som ser ut som en fyrkant med ett mini stapeldiagram inne i data analys programvara.
Anmärkning: Detta tar upp diagrammet att göra processen där det är möjligt att design diagram baserat på data som anges. - Välj stapeldiagram och indatavärden, utse menar siffrorna.
Obs: Diagrammet för menar nummer görs först, och sedan kolumnen standardavvikelsen för y-felstaplar designeras. För att göra detta, dubbelklicka på diagrammet barer, Välj fliken y-fel , klicka på alternativet anpassad och markera området i kalkylbladet för att ange platsen för Standardavvikelse data. Skillnaden mellan grupperna som behöver jämföras kan ses efter skapandet av de önskat diagram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Membranet fraktionering:
Ultracentrifugering användes för fraktioneringen av membran och cytosolen komponenter. Som visas i figur 1, supernatanten innehåller den cytosoliska fraktionen och pelleten innehåller den membran-fraktionen. Överflödet av RhoA cytosoliska andmembrane fraktioner erhålls från U251 celler undersöktes efter behandlingen med simvastatin använder immunoblotting. Renhet och lastning kontroll i bråket som membran och cytosolen bekräftades av pan-Cadherin och GAPDH respektive. Som visas i figur 2, minskat simvastatin behandling mängden membran-bundna RhoA GTPase, medan det ökade dess cytosoliska innehåll. Detta är förenligt med de kända effekterna av statiner på på flyttning av GTPases baserat på hämning av RhoA prenylation. Simvastatin hämmar prenylation av RhoA GTPase, och därför unprenylated RhoA är oförmögen att förankra i plasma cellmembran, vilket resulterar i dess högre cytosoliska koncentrationer.
RhoA-GTP bundna:
Vi mätte GTP-bundna RhoA protein med en GTPase-linked immunosorbent assay och visade att simvastatin signifikant (P < 0,05) ökade GTP-bundna RhoA i U251 celler (figur 3). Därför, medan simvastatin hämmas RhoA GTPase protein prenylation (figur 2), ökade också dess GTP lastning jämfört med kontroll cellerna. Detta pekar på det faktum att prenylation och GTP bindande både spela en roll i verksamheten och reglering av RhoA GTPase. För ytterligare detaljer om detta fenomen, hänvisas till den ursprungliga publikationen som använder detta protokoll8.
Figur 1 : Schematisk vy av de cytosoliska och membran fraktionerna efter ultracentrifugering. Pelleten innehåller den membran-fraktionen och supernatanten innehåller den cytosoliska fraktionen.
Figur 2 : Simvastatin ändras localizationen av RhoA. U251 celler behandlades med simvastatin (10 µM; 12, 24 och 36 h) och överflödet av RhoA i membranet och cytosoliska fraktioner bestämdes av immunoblotting. GAPDH och pan-Cadherin överflödet bedömdes även till kontrollen för lastning i cytosoliskt och membran fraktioner och bekräfta avsaknaden av cytosoliska kontaminering i membran fraktioner. Uppgifterna är vanligtvis från tre oberoende experiment med olika primära cellkulturer. Denna siffra har ändrats från Alizadeh o.a. 8. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 : Simvastatin modulerar RhoA GTPase aktivitet. Den GTPase-linked immunosorbent assay användes för att mäta GTP-bundna Rho protein i U251 celler. Olika villkor testades för 36 h, inklusive svält och simvastatin (10 µM). För varje experiment användes ett konstitutivt aktiv RhoA protein i kit som positiv kontroll. Resultaten uttrycks som den medelvärde ± SD för två replikat i oberoende experiment (* P < 0,001). Denna siffra har ändrats från Alizadeh o.a. 8.
| Cell kultur fartyg | Yta (cm2) | Lyseringsbuffert (µl) | |
| Rätter | 35 mm | 9 | 100 |
| 60 mm | 21 | 300 | |
| 100 mm | 55 | 700 | |
| 150 mm | 145 | 1500 | |
| Tallrikar | 6-väl | 9,4 / väl | 100 |
| 12-väl | 3,8 / väl | 70 | |
| 24-väl | 1.9 / väl | 40 | |
| Kolvar | T-25 | 25 | 250 |
| T-75 | 75 | 1000 | |
| T-150 | 150 | 1500 | |
Tabell 1: Rekommenderas volymer lyseringsbuffert för U251 celler. Volymen är justerbar för olika celltyper.
| Lysis buffert namn | Lysis buffert sammansättning | Lilla G-Protein mål | Anteckningar |
| GL35 | Tris (1 X GL36), MgCl2 (8 X GL36), NaCl (2 X GL36), IGEPAL (1 X GL36), SDS (5 X GL36) | Cdc42 | Identiska komponenter till GL36, sammansättning varierar enligt följande; |
| GL36 | en egenutvecklad formulering av Tris pH 7.5, MgCl2, NaCl, IGEPAL och SDS | RalA | Standard buffert, kompatibel med mest GTPase-linked immunosorbent assays. |
| GL36 | en egenutvecklad formulering av Tris pH 7.5, MgCl2, NaCl, IGEPAL och SDS | Rac1 | Standard buffert, kompatibel med mest GTPase-linked immunosorbent assays. |
| GL36 | en egenutvecklad formulering av Tris pH 7.5, MgCl2, NaCl, IGEPAL och SDS | Rac1, 2, 3 | Standard buffert, kompatibel med mest GTPase-linked immunosorbent assays. |
| GL36 | en egenutvecklad formulering av Tris pH 7.5, MgCl2, NaCl, IGEPAL och SDS | Ras | Standard buffert, kompatibel med mest GTPase-linked immunosorbent assays. |
| GL36 | en egenutvecklad formulering av Tris pH 7.5, MgCl2, NaCl, IGEPAL och SDS | RhoA | Standard buffert, kompatibel med mest GTPase-linked immunosorbent assays. |
| GL36 | en egenutvecklad formulering av Tris pH 7.5, MgCl2 | Arf1 | Standard buffert, kompatibel med mest GTPase-linked immunosorbent assays. |
Tabell 2: Lista av GTPase-linked immunosorbent assay lysis buffertar och rekommenderade lysis sammansättning för små GTPases.
| Parametrar | Anteckningar | ||
| VINST | VINST alternativet justerar maskinen känsligheten. De flesta luminometers använder automatisk kalibrering eller begränsad kalibreringsfunktion. Användare bör läsa vinsten på låg, medium, och hög för att se om behandlingen är inom det linjära området som varierar i olika instrument. | ||
| INTEGRATION TID | Det rekommenderas att ha detta alternativ på dess lägsta som de mycket höga tider kan läsa ur det linjära området. Detta kan kräva onödigt arbete som att använda lägre utspädning eller primära och sekundära antikroppar. INTEGRATION tid varierar också i olika instrument. | ||
| SKAKA | Det är rekommenderat att använda 5s orbital SKAKNINGAR. Det är inte lika kritisk som andra parametrar för riktigheten i analysen. | ||
| TEMPERATUR | Rumstemperatur är rekommenderad | ||
| PLÅT TYP | Använd enligt plattan du använder. Plattan är oftast 96 brunnar, platt och vit. | ||
| FILTER | Excitation eller utsläpp filter krävs inte för luminiscens. Excitation kan ställas in på någon önskat värde och optimal räckvidd för utsläpp är 430-445 nm. Lämna utrymmen i filtret tomt. Om detta inte är ett alternativ, | ||
Tabell 3: En detaljerad beskrivning av luminometer inställningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi en noggrann metod för att mäta små GTPase prenylation och GTP bindande visas som små GTPase subcellulär lokalisering (membran kontra cytosol) och Rho GTP lastning. Små GTPases uttrycks i eukaryota celler och spela avgörande roller i cellulär proliferation, motilitet och struktur. Både prenylation och GTP bindande är involverade i regleringen av GTPase verksamhet. Därför är analyser att utvärdera prenylation och GTP bindningen av dessa proteiner viktiga verktyg för cell biologer1,8.
Baserat på resultaten av en nyligen genomförd studie, Rho protein GTP lastning är celltyp specifika8, och därför skiljer sig mellan olika celltyper. Även är de subcellulär lokalisering och geranylgeranylation (GGT) av Rho proteiner de avgörande stegen i regleringen av deras funktion. Detta regleras också av samspelet mellan effektor proteinerna GEF, GAP och GDI för den stora GTPases.
Simvastatin är känt för att öka Rac GTP lastning i THP-1 monocyter, minska prenylation av Rac i närvaro av amyloid β stimulering och minska inflammatoriska svar från dessa celler17. Vi vet också att T-cells funktion påverkas inte av Rho GTP lastning, men snarare GGT av Rho avgör funktionen18,19. Därför rekommenderar vi att, för att upptäcka Rho GTPase aktivitet, både prenylation och GTP lastning måste mätas samtidigt i celler.
Notera, att uppnå hög renhet cytosoliska och membran fraktioner, är de viktigaste stegen i protokollet ultraljudsbehandling och ultracentrifugering. För Rho GTP-bindande analysen, den mest kritiska steget är snapin-frysning i cell lysates innan sekventiell behandling. Följande viktiga steg kommer att producera konsekventa och reproducerbara resultat i studien av GTPases i levande system.
Ett viktigt steg att undersöka en viss intracellulära struktur eller membran protein är separationen av cellulära fack från varandra. Fraktionering utnyttjar egenskaperna för varje mobilfack, som storlek och form, yta laddningstätheten och livaktig densitet20. Den är huvudsakligen baserad på differentiell centrifugering i medier av hög viskositet vid 4 ° C. Metoden membran fraktionering som användes här baseras främst på storleken av varje fack och på hög gravitationella hastighet om det efter ultracentrifugering, membranproteiner gå till botten av röret och de cytosoliska proteinerna kvar i den supernatanten.
Det är viktigt att notera att prover som innehåller hög proteinhalt koncentrationer och, eventuellt, höga nivåer av luckor kan potentiellt inaktivera målet GTPase. Det här problemet kan uppstå även i lyseringsbuffert och kan leda till falskt negativa resultat. En av de centrala parametrar som avgör framgången och reproducerbarhet av GTPase aktivitet assay resultat är hälsa och lyhördhet av cellerna som används i experiment8. Det rekommenderas starkt att utredarna identifiera optimala/lämplig tillväxt villkorar och fördubbling tid för cellerna under studie för att fastställa GTPase aktivering/hämning. Dessutom alla små GTPases GTPase verksamhet är hårt reglerad och är därför mottagliga för snabba minskningar via hydrolys av GTP molekylen bunden till den enzym via åtgärden av luckor (under och efter förfarandet cell lysis ). Denna åtgärd resulterar i snabba inaktivering av GTPase av intresse. Det rekommenderas därför starkt att cellys utförs snabbt vid 4 ° C, för att uppnå exakta och reproducerbara resultat.
I området i närheten finns det flera faktorer beroende på experimentella förhållanden som avgör den slutliga cellen lysate. Första, den totala mängden RhoA GTPase i cellen fodrar eller specifik vävnad: mängden endogena RhoA GTPase är variabel i olika typer av celler och vävnader; Därför kan detta resultera i ett kraftfullare svar till en aktivare eller deactivator. Andra, mängden aktivering/avaktivering uppnått de experimentella villkor: det är viktigt att tänka på att cirka 2% och 10% av den totala cellular små GTPase möjligen aktiveras som svar på en viss stimulus8. Mängden avaktivering också enbart beror på vilken typ av stimuli och det är variabel i olika celler och vävnader. Därför, för varje typ av små Rho GTPase aktivitet assay, sammansättningen av Lys buffert och cellulära kupén är avgörande. Tabell 3 visar den rekommendera sammansättningen av lyseringsbuffert för varje specifikt små GTPase protein.
Normaliserade cell lysate protein koncentrationen är ett stora krav eftersom det gör att utredarna att jämföra GTPase aktiviteten av olika prover. Tvätta cellerna från alla prover i alla förhållanden med kall PBS är därför obligatoriskt att ta bort protein från vävnadsodling media. Det är också viktigt att alla reagenser och buffertar används vid kalla temperaturer (4 ° C) i alla steg av experimentet. Denna kyla kommer att minimera hydrolys av GTPases, inklusive Rho GTPase, under provberedning. Det är viktigt att denna bearbetning av cell lysates sker snabbt (i 10-15 minuter totalt) för att undvika förlust av RhoA GTPase aktivitet. Dessutom är det viktigaste steget i cell lysate beredning till snapin-frysa alikvoter av den lysate i flytande kväve för att upprätthålla den RhoA små GTPase enzymatiska aktiviteten. Detta är särskilt viktigt om det finns olika tidpunkter eller flera prover i experimentet. Efter beredning av snapin-fryst lysates, kan proverna förvaras i-80 ° C utan att förlora sin Rho GTPase verksamhet.
Medföljande protokollet för analys av membran förankringen av RhoA GTPase representerar bara en indirekt verktyg för att mäta prenylation av små GTPases och kan inte direkt identifiera eller kvantifiera bindningen av isoprenoid rester till målproteinet. Detta är en av de mycket få begränsningarna av denna analys. Därför, det ger en uppskattning av prenylation av proteiner. Vissa metoder har definierats som klarar att direkt mäta FT (farnesylation) och/eller GGT genom farnesyl transferas eller geranylgeranyl transferas, respektive, både i odlade celler, djur och människa tumörer. Analyserna använder elektroforetiska mobilitet Skift, [3H] farnesyl difosfat och [3H] geranylgeranyl difosfat och [3H] mevalonic syra märkning, följt av immunoprecipitation och SDS-PAGE21.
Vi använde den RhoA GTPase-linked immunosorbent assay för att upptäcka membran förankring och aktiviteten av RhoA GTPase. Den består av en Rho-GTP-bindande protein som är kopplad till brunnarna av en plattan med 96 brunnar. Så, den GTP-bundna aktiva Rho i cell eller vävnad lysates binder till brunnar, medan BNP-bundna inaktiva Rho tvättas bort under tvätt stegen. Sedan, den bundna, aktiv RhoA i brunnarna identifieras med hjälp av en RhoA-specifika antikroppar och chemiluminescence. Det är möjligt att bestämma graden av RhoA aktiveringen genom att jämföra mätvärden från aktiverade till nonactivated cell lysates. Serum svält (användning av serumfritt medium på odlade celler) används oftast för att inaktivera RhoA i vävnadskultur. Det bör också nämnas att den GTPase-linked immunosorbent assay's utbud av aktiveringen kräver 10-50 µg av protein för detektion av RhoA GTPase aktivitet.
Det rekommenderas starkt att obehandlad prover har låga basala cellulära nivåer av GTPase verksamhet (Styrläget). Som exempel, rätt cell svält förhållanden kan downregulate GTPase aktivitet och ger idealiska förutsättningar att visa deras aktivering under experimentella förhållanden. Både aktivering och hämning analyser utförs också, i en tid - och dos-respons-sätt för att få bästa GTPase aktivering/hämning svaren. Viktigare, under cellulära beredning, det är mycket viktigt att använda celler som inte är overconfluent (> 70%), för att undvika eventuella nonresponsiveness av celler aktivering/hämning stimuli.
Luminometers skiljer sig mycket åt när det gäller känslighet och absoluta värden. Vi föreslår därför, för att fastställa att det är i det linjära området, kör en GTPase-linked immunosorbent assay med en blank och en positiv kontroll. Om analysen är av det linjära området (den positiva kontrollen bör vara 4 x - 10 x högre än buffert-bara läsningen) eller tom läsning är högre än 9-10 miljoner, så det rekommenderas att använda ytterligare antikropp utspädningar. Dessutom rekommenderar vi kalibrera luminometern att läsa inom det linjära området analysens innan du börjar analysen.
Det finns också fördelar med att den GTPase-linked immunosorbent assay som är värda att nämna. GTPase-linked immunosorbent assays förbättra nuvarande experimentell design och aktivera teknik att underlätta experiment som inte var möjligt med gamla rullgardinsmenyerna tekniker22. De GTPase-linked immunosorbent assays ger också upptäckt noggrannhet och känslighet som gör analyser av GTPase aktivitet i beredningar tidigare tabu för nedrullningsbara analyser23. Ett par nyare studier jämfört GTPase-linked immunosorbent aktiveringen analyser med pull-downs och fann att GTPase-linked immunosorbent assay har några tydliga fördelar, nämligen som GTPase-linked immunosorbent assays är överlägsna beror på deras förmåga att använda små mängder protein22,24, deras större känslighet24och deras kvantitativa mätningar23. GTPase-linked immunosorbent assay kit finns i antingen luminometric eller kolorimetriska upptäckt versioner, där luminometric analyserna är känsligare. Denna GTPase-linked immunosorbent assay är baserat på ett ganska enkelt och snabbt protokoll, kräver endast små mängder prov, och ger kvantitativa och korrekta resultat. Därför kan det vara en bra idé att vidareutveckla denna analys för att upptäcka andra typer av GTPase-baserade proteiner i olika cellinjer och vävnadsodling celler med en mycket högre specificitet och noggrannhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Saeid Ghavami stöddes av hälsa Science Centre löpande bidrag, CHRIM grant och Manitoba nya utredare löpande forskningsbidrag. Javad Alizadeh stöddes av forskning Manitoba STUDENTTILLVARO. Shahla Shojaei stöddes av Health Science Foundation löpande bidrag och den MITACS påskynda postdoktorsstipendium. Adel Rezaei Moghadam stöddes av en NSERC som löpande bidrag som hölls av Joseph W. Gordon. Amir A. Zeki stöddes av NIH/NHLBI K08 tilldelning (1K08HL114882-01A1). Marek J. Los vänligt bekräftar stödet från NCN bevilja #2016/21/B/NZ1/02812, stöds av LE STUDIUM Institute for Advanced Studies (region Centre-Val de Loire, Frankrike) genom dess Smart Loire Valley allmänna Program och medfinansieras av Marie Sklodowska-Curie-åtgärderna, bevilja #665790. Simone da Silva Rosa stöddes av UMGF STUDENTTILLVARO.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high Glucose | VWR (Canada) | VWRL0101-0500 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR (Canada) | CA45001-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR (Canada) | 97062-806 | |
| EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CA71007-118 | |
| EGTA (Ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CAAAJ60767-AE | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | VWR (Canada) | CA97061-340 | |
| Ammonium Persulfate | VWR (Canada) | CABDH9214-500G | |
| Tris-Hydroxymethylaminomethane | VWR (Canada) | CA71009-186 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution | Biorad (Canada) | 1610158 | |
| TEMED | Biorad (Canada) | 1610801 | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma/Aldrich (Canada) | P8340-5ML | 1:75 dilution |
| Rho-GTPase Antibody Sampler Kit | Cell Signaling (Canada) | 9968 | 1:1000 dilution |
| Pan-Cadherin antibody | Cell Signaling (Canada) | 4068 | 1:1000 dilution |
| GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology (USA) | sc-69778 | 1:3000 dilution |
| RhoA G-LISA Activation Assay (Luminescence format) | Cytoskeleton Inc. (USA) | BK121 | Cytoskeleton I. G-LISA Activation Assays Technical Guide. 2016. |
| RhoA Antibody | Cell Signaling | 2117 | |
| ECL | Amersham-Pharmacia Biotech | RPN2209 | |
| Anti-Rabbit IgG (whole molecule) Peroxidase antibody | Sigma | A6154-1ML | |
| SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | 1612071A | Spectrophotometer |
| Nonidet P-40 | Sigma | 11332473001 | non-denaturing detergent, octylphenoxypolyethoxyethanol |
| DMSO | Sigma | D8418-50ML | |
| PBS | Sigma | P5493-1L | |
| Phophatase Inhibitor cocktail | Sigma | P5726-5ML | 1:75 Dilution |
References
- Yeganeh, B., et al. Targeting the mevalonate cascade as a new therapeutic approach in heart disease, cancer and pulmonary disease. Pharmacology & Therapeutics. 143 (1), 87-110 (2014).
- Valencia, A., Chardin, P., Wittinghofer, A., Sander, C. The ras protein family: evolutionary tree and role of conserved amino acids. Biochemistry. 30 (19), 4637-4648 (1991).
- Hall, A.
- Rojas, A. M., Fuentes, G., Rausell, A., Valencia, A. The Ras protein superfamily: evolutionary tree and role of conserved amino acids. The Journal of Cell Biology. 196 (2), 189-201 (2012).
- Cherfils, J., Zeghouf, M. Regulation of small GTPases by GEFs, GAPs, and GDIs. Physiological Reviews. 93 (1), 269-309 (2013).
- Shojaei, S., et al. Perillyl Alcohol (Monoterpene Alcohol), Limonene. Enzymes. 36, 7-32 (2014).
- Ghavami, S., et al. Airway mesenchymal cell death by mevalonate cascade inhibition: integration of autophagy, unfolded protein response and apoptosis focusing on Bcl2 family proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (7), 1259-1271 (2014).
- Alizadeh, J., et al. Mevalonate Cascade Inhibition by Simvastatin Induces the Intrinsic Apoptosis Pathway via Depletion of Isoprenoids in Tumor Cells. Scientific Reports. 7, 44841 (2017).
- Ghavami, S., et al. Mevalonate cascade regulation of airway mesenchymal cell autophagy and apoptosis: a dual role for p53. PLoS One. 6 (1), e16523 (2011).
- Tang, Y., Olufemi, L., Wang, M. T., Nie, D. Role of Rho GTPases in breast cancer. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13, 759-776 (2008).
- DerMardirossian, C., Bokoch, G. M. GDIs: central regulatory molecules in Rho GTPase activation. Trends in Cell Biology. 15 (7), 356-363 (2005).
- Garcia-Mata, R., Boulter, E., Burridge, K. The 'invisible hand': regulation of RHO GTPases by RHOGDIs. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 493-504 (2011).
- Etienne-Manneville, S., Hall, A.
- Ghavami, S., et al. Geranylgeranyl transferase 1 modulates autophagy and apoptosis in human airway smooth muscle. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (4), L420-L428 (2012).
- Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406 (6795), 532-535 (2000).
- Ghavami, S., et al. Statin-triggered cell death in primary human lung mesenchymal cells involves p53-PUMA and release of Smac and Omi but not cytochrome c. Biochimica et Biophysica Acta. 1803 (4), 452-467 (2010).
- Cordle, A., Koenigsknecht-Talboo, J., Wilkinson, B., Limpert, A., Landreth, G. Mechanisms of statin-mediated inhibition of small G-protein function. Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 34202-34209 (2005).
- Waiczies, S., Bendix, I., Zipp, F. Geranylgeranylation but not GTP-loading of Rho GTPases determines T cell function. Science Signaling. 1 (12), pt3 (2008).
- Waiczies, S., et al. Geranylgeranylation but not GTP loading determines rho migratory function in T cells. Journal of Immunology. 179 (9), 6024-6032 (2007).
- Satori, C. P., Kostal, V., Arriaga, E. A. Review on Recent Advances in the Analysis of Isolated Organelles. Analytica Chimica Acta. 753, 8-18 (2012).
- Berndt, N., Sebti, S. M. Measurement of protein farnesylation and geranylgeranylation in vitro, in cultured cells and in biopsies, and the effects of prenyl transferase inhibitors. Nature Protocols. 6 (11), 1775-1791 (2011).
- Keely, P. J., Conklin, M. W., Gehler, S., Ponik, S. M., Provenzano, P. P. Investigating integrin regulation and signaling events in three-dimensional systems. Methods in Enzymology. 426, 27-45 (2007).
- Oliver, A. W., et al. The HPV16 E6 binding protein Tip-1 interacts with ARHGEF16, which activates Cdc42. British Journal of Cancer. 104 (2), 324-331 (2011).
- Moniz, S., Matos, P., Jordan, P. WNK2 modulates MEK1 activity through the Rho GTPase pathway. Cellular Signalling. 20 (10), 1762-1768 (2008).
