Summary
Microglia zijn hersenen immune cellen die enquête en reageren op veranderde hersenen fysiologie via morfologische veranderingen die kwantitatief kan worden beoordeeld. Dit protocol schetst een ImageJ gebaseerd analyse protocol te vertegenwoordigen microglia morfologie als continu gegevens volgens de statistieken, zoals de restanten van de cel, complexiteit en vorm.
Abstract
Microglia zijn hersenen fagocyten die deelnemen aan de hersenen homeostase en voortdurend onderzoek hun omgeving voor dysfunctie, verwonding en ziekte. Als de eerste responders, microglia hebben belangrijke functies te verzachten neuron en glia dysfunctie, en in dit proces, zij een breed scala van morfologische veranderingen ondergaan. Microglia morphologies Samaraculturen kunnen worden gecategoriseerd en anderzijds kunnen worden gekwantificeerd als een continu variabele voor parameters, zoals de restanten van de cel, complexiteit en vorm. Terwijl de methoden voor het kwantificeren van microglia worden toegepast op afzonderlijke cellen, toepassen paar technieken op meerdere microglia in een hele gekleurd. Het doel van deze methode is te kwantificeren van meervoudige en enkelvoudige cellen met behulp van gemakkelijk beschikbare ImageJ protocollen. Dit protocol is een samenvatting van de stappen en ImageJ plugins aanbevolen fluorescentie en helder-veld photomicrographs converteren naar representatieve binair en skeletonized beelden en te analyseren met behulp van software plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D) en FracLac voor de verzameling van de gegevens van de morfologie. De uitgangen van deze plugins samenvatten cel morfologie in termen van proces eindpunten, kruispunten, en lengte evenals complexiteit, cel vorm en grootte descriptoren. Het skelet analyse protocol hierin beschreven is geschikt voor een regionale analyse van meerdere microglia binnen een gehele gekleurd of de regio van belang (ROI) Overwegende dat de FracLac biedt een aanvullende individuele cel analyse. Gecombineerd, voorziet het protocol in een objectieve, gevoelige en uitgebreide beoordeling hulpmiddel dat kan worden gebruikt voor het stratificeren tussen uiteenlopende microglia morphologies aanwezig in de hersenen gezond en gewonden.
Introduction
Microglia hebben een onmiddellijke en diverse morfologische reactie op veranderingen in de hersenen fysiologie1 langs een continuüm van mogelijkheden die variëren van hyper-restanten en zeer complexe morphologies-vertakte en Wortelpotigen morphologies2 . Microglia wellicht ook gepolariseerde en staafvormig3. Microglia cel restanten wordt meestal gedefinieerd als een complexe shape met meerdere processen en wordt vaak gemeld als het aantal eindpunten per cel en de lengte van de processen van de cel. Aangezien microglia zijn fijn afgestemd op neuronale en gliale functie t/m continu cel cross-talk en in vivo motiliteit4,5, kunnen microglia morphologies dienen als indicatoren van uiteenlopende cel functies en stoornissen in de hersenen. Een kwantitatieve benadering is nodig om voldoende beschrijven de diversiteit van deze morfologische veranderingen en het te onderscheiden van de verschillen tussen vertakte cellen die zich met subtiele fysiologische verstoringen (zoals epilepsie5,6 voordoen en hersenschudding7) naast bruto schade (zoals beroerte8). Een intensiever gebruik van morfologie kwantificering7,8,9,10,11,12,13,14 zal onthullen de volledige diversiteit van microglia morphologies tijdens gezondheid en ziekte. De huidige studie details de stapsgewijze gebruik voor ImageJ plugins nodig om samen te vatten microglia morfologie van TL of niet-belichting fluorescerende photomicrographs van microglia in vaste knaagdier weefsel na immunohistochemistry (IHC verworven).
Centraal aan de analysetechnieken die hier worden beschreven zijn de ImageJ plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D)15, ontwikkeld in 2010 tot grote borstklier structuren, kwantificeren en FracLac16, ontwikkeld in 2014 te integreren ImageJ en fractal analyse kwantificeren van individuele microglia vormen. Deze plugins bieden een snelle analyse van microglia restanten binnen de gehele photomicrographs of meerdere microglia van een gedefinieerde ROI binnen een gekleurd. Deze analyse kan alleen of in aanvulling met fractal analyse worden gebruikt. De eencellige fractal-analyse (FracLac) vereist een investering van tijd, maar biedt meerdere morfologie uitgangen met betrekking tot microglia complexiteit, vorm en grootte. Het gebruik van beide tools is niet overbodig, als cel restanten vormt een aanvulling op de complexiteit van de cel, en de combinatie van meerdere parameters kan worden gebruikt om te onderscheiden tussen uiteenlopende microglia morphologies binnen datasets12,17.
Protocol
Alle experimenten werden goedgekeurd door en uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren die zijn vastgelegd door de Universiteit van Arizona institutionele dierenverzorgers en gebruiken Comité en de NIH-richtsnoeren voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Zorg werd genomen om dierlijke pijn en ongemak te minimaliseren. Euthanasie methoden zijn volgens een goedgekeurde protocol en bestaan uit cervicale onthoofding onder Isofluraan verdoving.
1. de weefsels voorbereiding
Opmerking: Voer microglia morfologie analyse op vaste, cryoprotected weefselmonsters voor het behoud van de morfologie van de cel. Het volgende is een standaardprotocol voor te bereiden en direct slice vaste weefsel voor fluorescentie IHC.
- Verwijder muis of rat hersenen uit een euthanized dier na de gewenste experiment en volgens een standaard laboratorium protocol. Plaats van de hersenen in een 10 mL flesje met 5 mL van een 4% paraformaldehyde-oplossing gedurende 24 uur bij 4 ° C. Spoel en plaats in 5-10 mL van een 30% sacharose fosfaat gebufferde oplossing (PBS, 0,01 M) gedurende 72 uur bij 4 ° C. Slaan hele hersenen bij-80 ° C tot weefsel afdelen met een cryostaat, of bij 4 ° C als afdelen met een microtoom.
Opmerking: Dit protocol is nog niet getest met behulp van weefsel gesneden van paraffine-ingebedde weefsel. - Sectie het hersenweefsel naar de gewenste sectie dikte en oriëntatie met behulp van hetzij een cryostaat of microtoom en winkel vrij zwevende secties in een oplossing van de cryoprotection (50 mM PBS, Etheenglycol, glycerol) bij-20 ° C.
Opmerking: Dit protocol is met succes uitgevoerd op de coronale weefselsecties variërend van 50 µm tot 200 µm in dikte. Weefsel afdelingen minder dan 50 µm niet de volledige hoeveelheid microglia processen, terwijl in dikke weefselsecties vastleggen kan, IHC kleuring onvolmaakt zijn als gevolg van antilichaam penetratie in weefsel kan worden. Weefsel kan verdeelde ofwel in een coronale of Sagittaal oriëntatie en deze keuze zal afhangen van de experimentele doel en hersenen regio('s) worden bestudeerd.
2. Immunohistochemistry
Opmerking: Skelet en fractal analysemethoden kunnen worden toegepast op de fluorescentie- of 3, 3 '-diaminobenzidine (DAB) IHC. Het volgende is een standaard fluorescentie IHC protocol en kan zo nodig worden vervangen. Fluorescentie IHC levert superieure visualisatie van cel processen in vergelijking met DAB IHC.
- Plaats de weefselsecties in een 4 mL glazen ampul (maximaal 15 muis hersenen secties/injectieflacon) en incubeer met 1 mL van de oplossing dat niet meer dan 10% paard serum, PBS (0,01 M), 0,5% Triton, 0,04% NaN3 bij kamertemperatuur (23 ° C) voor 1 h bevat.
- Wassen voor 5 min met PBS (0,01 M) drie keer bij kamertemperatuur.
- Incubeer met het primaire antilichaam (Iba1, 1:1, 000) bij kamertemperatuur gedurende 72 uur in 1 mL van oplossing met PBS (0,01 M), 0,5% Triton, 0,04% NaN3en bedekt (voor het behoud van de effectiviteit van NaN3 ).
- Wassen voor 5 min met PBS (0,01 M) drie keer bij kamertemperatuur.
- Incubeer met het secundaire antilichaam (anti-konijn 488, 1:250) gedekt bij kamertemperatuur gedurende 4 uur in 1 mL van oplossing met PBS (0,01 M), 0,5% Triton, 0,04% NaN3
- Wassen voor 5 min met PBS (0,01 M) drie keer bij kamertemperatuur.
- De hersenen weefselsecties (aantal en oriëntatie op basis van voorkeur) mount op subbed dia's, een medium zachte-set montage toepassen op de dia en het dekglaasje aan te plaatsen over het weefsel. Opslaan van de dia's bij 4 ° C.
Opmerking: Een 1.5 dekglaasje aan glasdikte is vereist voor confocal imaging. Soft-set is een voorkeur montage medium omdat de hoge viscositeit het weefsel niet comprimeren doet en beste behoudt de morfologie in vergelijking met hard-set montage media.
3. beeldvorming
- Afbeelding Iba1 positieve cellen in de hersenen weefselsectie met behulp van een helder-veld of confocal microscoop welk heeft een z-stack overname geschiktheid met behulp van een 20 X objectieve of groter.
Opmerking: Imaging parameters en software set-up moet constant voor alle gekleurd overname in een experiment. Uitstekende proces detail wordt verkregen met behulp van een 40 X of 63 X doelstelling. Het is mogelijk om het protocol van de skeleton analyse die hierin worden beschreven om een volledige gekleurd of een ROI van meerdere cellen binnen een grotere gekleurd te passen.- 8-bits afbeeldingen met behulp van de juiste software-instellingen die specifiek voor de Microscoop software te verwerven.
Opmerking: De conversie van bestanden naar 8-bit na overname kan de gegevensverzameling worden vervormd. - Verwerven van minimaal 30 µm z-stack met niet meer dan een 2 µm interval tussen afbeeldingen met behulp van de juiste software-instellingen die specifiek voor de Microscoop software.
Opmerking: De Microscoop en de software laten voor Beeldacquisitie in een X, Y, en Z-as. Een z-stack kan worden verhoogd en het interval kan worden verlaagd om extra microglia detail. In ruil zal imaging tijd toenemen. Gebruik waar mogelijk Nyquist bemonstering voor fluorescentie microscopie.
- 8-bits afbeeldingen met behulp van de juiste software-instellingen die specifiek voor de Microscoop software te verwerven.
- Alle bestanden opslaan als Tif-bestanden of zoals vereist door de Microscoop software.
- De Tif-bestanden openen in ImageJ en gebruik de werkbalk om de kanalen door te klikken op Beeld splitsen | Kleur | Kanalen splitsen, en afbeeldingen stapelen door te klikken op afbeelding | Stapels | X Project | Maximale intensiteit projectie indien van toepassing. Opslaan als .tif-bestanden.
4. skelet analyse
- Downloaden van FIJI of ImageJ van < https://imagej.net/Fiji/Downloads>. Voor de individuele plugins, downloaden AnalyzeSkeleton(2D/3D) van < http://imagej.net/AnalyzeSkeleton>15 en download FracLac van < https://imagej.nih.gov/ij/plugins/fraclac/fraclac.html>16.
Opmerking: Het hele proces van het omzetten van een gekleurd in een binaire skeletonized image duurt minder dan 1 min. - Als met behulp van een fluorescentie gekleurd, schakelt dat het beeld is 8-bits en omzetten in grijswaarden om te visualiseren best alle positieve kleuring. Gebruik de werkbalk en klikt u op de afbeelding | Opzoektabellen | Greys. Als met behulp van een DAB helder-veld foto, het eerste gebruik de FFT bandfilter filter plugin (met behulp van de werkbalk door te klikken op proces | FFT | bandfilter filter) en vervolgens omzetten in grijswaarden.
Opmerking: Voor de toepassing van dit protocol, ImageJ standaardinstellingen voor een FFT Bandfilter Filter zijn voldoende (filter maximaal 3 pixels, tot 40, geen streep onderdrukking). Een FFT bandfilter filter wordt toegepast, verwijdert u ruis (kleine elementen) met behoud van de over het algemeen grotere aspecten van de afbeelding. Dit is vooral handig in helder veld beelden, waar wordt gesplitst en scheuren in het weefsel kunnen worden weergegeven als achtergrond en dus bemoeilijken de skeleton analyse18. - De helderheid en het contrast aanpassen als het beeld ook dim is en het microglia proces niet kan worden gevisualiseerd. Gebruik de werkbalk en klikt u op de afbeelding | Aanpassen | Helderheid/Contrast. Pas de schuifregelaars voor minimum- of maximumwaarde zo nodig, tot de randen van het histogram, maar geen verdere.
Opmerking: In ImageJ, helderheid en contrast zijn veranderd door het bijwerken van de afbeelding opzoektabel (LUT), zodat de pixelwaarden ongewijzigd zijn gebleven. Max en min schuifregelaars bepalen de grenzen van het boven- en ondergrenzen van het bereik van de display, met pixelwaarden boven 255 verschijnen witte en pixelwaarden onder 0 zwart18verschijnen. In het geval van fluorescentie photomicrographs, moet de maximale schuifregelaar worden gebruikt, terwijl de minimale schuifregelaar zal worden gebruikt voor photomicrographs van DAB microglia gekleurd. - Voer een filter Onscherp masker om het contrast met de werkbalk door te klikken op proces verder te verhogen | Filters | Onscherp masker. Voor de toepassing van dit protocol, ImageJ de standaardinstellingen (een pixel straal van 3 en gewicht van 0,6 te maskeren) worden gebruikt.
Opmerking: Onscherp masker scherpt en verbetert de functies van de rand van een afbeelding door een vage versie van de afbeelding (het filter Onscherp masker) van het origineel af te trekken, en vervolgens samenvoegen het resulterende beeld met een hoog contrast versie van de oorspronkelijke afbeelding. Daarom is het filter Onscherp masker maakt geen details, maar eerder verduidelijkt de bestaande detaillering van een afbeelding. De straal die u instelt, verandert hoe wazig de Onscherp masker zal worden (en dus hoeveel vervagen wordt verwijderd), en het gewicht van het masker u instelt, verandert de mate van contrast die het filter Onscherp masker zal worden samengevoegd met (en dus Hiermee past u het contrast van de uiteindelijke afbeelding). - Voer een despeckle stap Schakel peper ruis gegenereerd door het filter Onscherp masker. Gebruik de werkbalk en klik op proces | Lawaai | Uitstippen,.
Opmerking: Ontvlekken verwijdert u de ruis van de peper door elke pixel te vervangen door de gemiddelde waarde in de buurt van de 3 × 3. Het effect is dat uitschieters in intensiteit worden vervangen door de mediaan pixel zonder de scherpte van de randen18. - De afbeelding converteren naar een binair getal met behulp van de werkbalk door te klikken op afbeelding | Aanpassen | Drempel.
Opmerking: Thresholding stratifies de grijswaardenafbeeldingen in kenmerken van belang ten opzichte van de achtergrond en wordt de afbeelding omgezet in binaire18. - Toepassen van de despeckle, dicht-, en verwijderen van uitschieters functies: In het resulterende binaire beeld, kunnen er één pixel achtergrondgeluiden en de kloof tussen processen.
- De functie van de despeckle met behulp van de werkbalk door te klikken op proces van de toepassing | Lawaai | Uitstippen,.
Opmerking: Toepassing ontvlekken naar de binary afbeelding verwijdert u de eventuele resterende single-pixel ruis. - De nauwe functie met behulp van de werkbalk door te klikken op proces van de toepassing | Binaire | Nauwe.
Opmerking: Deze plugin verbindt twee donkere pixels, als ze worden gescheiden door maximaal 2 pixels. - Het verwijderen uitschieters functie met behulp van de werkbalk door te klikken op proces van de toepassing | Lawaai | Verwijderen van Outliers.
Opmerking: Voor de toepassing van dit protocol, heldere uitschieters zijn gericht met een pixel straal van 2 en een drempel van 50. Deze plugin vervangt een lichte of donkere uitbijter pixel door de mediaan pixels in de omgeving als het afwijkt door meer dan een bepaalde waarde (de drempel)18.
- De functie van de despeckle met behulp van de werkbalk door te klikken op proces van de toepassing | Lawaai | Uitstippen,.
- Sla de afbeelding op als een afzonderlijk bestand voor toekomstig gebruik en/of fractal analyse en skeletonize van het beeld met behulp van de werkbalk door te klikken op proces | Binaire | Skeletonize.
- Selecteer de skeletonized afbeelding en run de plugin AnalyzeSkeleton(2D/3D) met behulp van de werkbalk door te klikken op Plugins | Skelet | Analyseren van skelet, en de Branch informatie vakje aan te vinken.
Opmerking: Het is waarschijnlijk dat de beeldverwerking optimalisatie met de toevoeging of verwijdering van de hierboven voorgestelde stappen vereist. In dit proces, worden skeletonized beelden beoordeeld voor nauwkeurigheid door het creëren van een bedekking van het skelet en de oorspronkelijke afbeelding. SOMA moet één oorsprong punten met processen die afkomstig zijn van het centrum; circulaire Soma verwarren de gegevens en moeten worden vermeden door middel van aanpassing van het protocol. Een voorbeeld van een enkele oorsprongpunt versus circulaire Soma wordt geïllustreerd in Figuur 1.
Veelvoorkomende problemen resulterend in niet-representatieve skeletten en oplossingen voorgesteld:
- Afbeelding ook dim: converteren naar grijswaarden, schuifregelaars voor helderheid/contrast aanpassen, en/of onscherp masker toepassen
- Teveel achtergrond: schuifregelaars voor helderheid/contrast aanpassen, toepassen van Despeckle, en/of verwijderen van uitschieters
- Circulaire Soma in skeletonized afbeelding (met name voor fluorescentie afbeeldingen): FFT bandfilter filter en/of onscherp masker toepassen
- Scheuren in weefsel (met name voor heldere-veld afbeeldingen): FFT bandfilter filter toepassen, en/of het ontvlekken
- Kopieer alle van de gegevens van de resultaten en Branch informatie uitgangen en de gegevens in een Excel-werkblad plakken.
- Trim de gegevens Schakel skelet fragmenten die uit de overname van IHC en afbeelding voortvloeien in Excel.
- Dupliceren van de werkmap van het experiment met de uitvoer van de ruwe gegevens van skelet analyse en TRIM aan filename toevoegen. Alle daaropvolgende gegevens trimmen moet optreden in de gedupliceerde werkmap de ruwe gegevens voor toekomstig gebruik en verwijzing te bewaren.
- Bepalen welke lengte van fragmenten uit de dataset wordt bijgesneden door de skeletonized openingsafbeelding in ImageJ en te selecteren van het hulpmiddel lijn. Meten van meerdere fragmenten, neemt nota van de gemiddelde lengte, en besluiten tot een grenswaarde.
Opmerking: Voor de toepassing van de hier gepresenteerde gegevens, de cutoff lengte voor ongewenste fragmenten is 0,5. Deze waarde moet consistent een dataset. - Aangepaste sorteren het Excel-werkblad door te klikken op Sort & Filter | Aangepaste sortering. Sorteren op "eindpunt voxels" van grootste naar kleinste en, in een nieuw niveau, door "Mx tak pt" van grootste naar kleinste.
- Verwijderen van elke rij met 2 eindpunten met een maximale lengte van minder dan de grenswaarde (dwz., 0.5). Optellen van de gegevens in de kolom van de eindpunten voor het berekenen van het totale aantal eindpunten verzameld uit de afbeelding.
- Herhaal dit voor gegevens van de tak: sorteren 'lengte van de tak' van grootste naar kleinste. Blader door de gegevens en elke rij met een lengte van minder dan de cutoff waarde verwijderen(dwz., 0.5). Som van de waarden in de kolom lengte tak voor het berekenen van de opgeteld lengte van alle takken verzameld uit de afbeelding.
- Herhaal stappen 4.11.3-4.11.5 voor elke afbeelding per vel nadat alle gegevens zijn bijgesneden en opgeteld.
- De gegevens van elk beeld (aantal eindpunten opgeteld en vatte tak lengte) deelt door het aantal microglia Soma in de corresponderende afbeelding. De definitieve gegevens (eindpunten/cel & tak lengte/cel) aangaan statistische software.
Opmerking: De opgetelde tak lengte/celgegevens voorschrijven conversie van lengte in pixels naar micron.
5. fractal analyse
Opmerking: FracLac is kundig voor stormloop een aantal analyses van de andere shape die niet vallen in dit protocol. Voor een meer gedetailleerde uitleg van de FracLac van diverse functies, Raadpleeg de handleiding van de FracLac op < https://imagej.nih.gov/ij/plugins/fraclac/FLHelp/Introduction.htm> en bijbehorende verwijzingen 2,16,19. Fractal analyse maakt gebruik van het protocol stappen 4.1-4.7 hierboven beschreven.
- Bepaal de grootte van de ROI die zal worden gebruikt voor alle analyses van de fractal. Gebruik het rechthoekgereedschap om te tekenen van de ROI. Zorgen dat het vak groot genoeg is om het vastleggen van de gehele cel en consistent de dataset blijven kunt.
Opmerking: Gebruik de selectie rechthoek in plaats van de freehand selectie om ervoor te zorgen dat alle ROIs de dezelfde grootte rechthoek, en dus de cellen dezelfde schaal hebben. Dit zou niet het geval als de freehand selectie werden gebruikt omdat ImageJ zal auto-schaal een vierkante ROI te passen verschillende formaat rechthoekige Vensters resulterend in cellen met verschillende schalen. Terwijl fractale vormen schaal-onafhankelijk zijn, is de fractal analyseproces met behulp van FracLac voor ImageJ afhankelijk van de schaal16. Er is dus de behoefte aan een consistent formaat ROI in de gehele gegevensverzameling. - Selecteer willekeurig microglia fractal p.a. in elke gekleurd en bijbehorende binaire beeldoverdracht. Selecteer in het venster van de manager ROI, Update te lock de ROI op de positie van de cel. Gebruik Ctrl + Shift + D om te dupliceren het gebied binnen de ROI als een nieuw venster, en sla vervolgens de bijgesneden cel. Dupliceren op de bijbehorende binaire afbeelding (uit de skeleton analyse), het gebied met dezelfde cel gebruikend de manager van de ROI. Herhaal totdat een voldoende aantal cellen zijn willekeurig geselecteerd fractal p.a. en opslaan van alle bestanden.
Opmerking: Een random number generator en een genummerde raster inzetbaar willekeurig om cellen te selecteren. - Open de binaire afbeelding met de afzonderlijke cel. Dubbelklik op het gereedschap Penseel, de kleur ingesteld op zwart en pas de breedte van de penseel zo nodig. Met de bijpassende gekleurd als referentie, kunt het penseel verwijderen van aangrenzende cel processen, verbinden van gefragmenteerde processen en isoleren van de cel van belang. Zodra de binaire cel geïsoleerd is, sla het binaire bestand.
Opmerking: Het houden van 'alt' zal schakelen het penseel van de voorgrondkleur (zwart) op de achtergrondkleur (wit) - De binaire cel omzetten in een overzicht met de werkbalk via proces | Binaire | Overzicht.
Opmerking: FracLac voor Image J kan worden gebruikt op beide vaste vormen of vorm uit te stippelen huidige overeenkomst is echter shape gebruiken schetst16. - Open in de werkbalk, FracLac met behulp van de werkbalk door te klikken op Plugins | Fractal analyse | FracLac en selecteer BC (vak tellen). In de instellingen voor Raster Design instellen Num G tot en met 4. Onder de grafische opties, het selectievakje Statistieken om het convex omhulsel en de omsluitende cirkel van de cel te analyseren. Selecteer OKals u klaar bent.
Opmerking: Num G is het aantal vak tellen raster oriëntaties gebruikt tijdens het scannen en het aanbevolen bereik voor Num G 4-12. De instelling van de Num G en het voorgestelde bereik is grondig herzien in de FracLac handmatige16. Verhoging van Num G kan de berekening keer aanzienlijk vertragen. FracLac instellingen moet alleen eenmaal per sessie worden ingesteld. Nadat de instellingen zijn ingevoerd, zal de scanknop beschikbaar komen. - Selecteer de knop scannen een vak-tellen scan uitvoeren op de geselecteerde afbeelding.
Opmerking: De scan zal het genereren van drie vensters met data output: Hull en cirkel resultaten, vak graaf samenvatting bestand en Scan typen. Het venster scannen typen bevat een logboek van de instellingen die worden gebruikt, zo goed als standaard afwijkingen voor bepaalde maatregelen. Voor de toepassing van dit protocol, kan het venster scannen typen niet wordt gebruikt en worden gesloten of opgeslagen voor toekomstig gebruik. - Kopieer alle gewenste gegevens in het venster Hull en Resultaten van de cirkel (dwz., dichtheid, span verhouding en cirkelvormigheid) resultaten. Kopieer de gewenste gegevens in het venster Vak graaf samenvatting (dwz., Fractale dimensie en lacunarity) resultaten. De gekopieerde gegevens overbrengen naar een Excel-bestand of statistische software.
Opmerking: Een volledige lijst van de FracLac uitvoer gegevens zijn verstrekt en grondig uitgelegd in de FracLac voor ImageJ handmatige16.
Representative Results
De microglia morfologie analyse protocollen hierin beschreven samenvatten stappen behulpzaam bij de verwerking van TL en DAB photomicrographs voor Morfometrische analyse. Deze stappen zijn visueel samengevat in Figuur 2 en Figuur 3. Het doel van deze stappen is een representatieve binair en skeletonized afbeelding die op de juiste wijze de oorspronkelijke gekleurd modellen zodanig zijn dat de verzamelde gegevens geldig zijn. Na de looptijd van het protocol, de plugin AnalyzeSkeleton resulteert in een gecodeerde skelet afbeelding waarvan het aantal eindpunten en tak (dwz., proces) lengthcan van de resulterende output bestanden worden samengevat. Eindpunten en proces lengtegegevens worden vervolgens gebruikt om te schatten van de omvang van microglia restanten in de gekleurd of ROI. Figuur 4 geeft een overzicht van de resulterende gegevens (eindpunten/cel- en proces lengte/cel) met en zonder de toepassing van het protocol. Hoewel vergelijkbare tendensen bestaan, zijn de gegevens samengevat in figuur 4F minder variabel dan die in figuur 4E. Bovendien deze gegevens illustreren verhoogde gevoeligheid voor het detecteren van de verschillen tussen groepen wanneer het protocol wordt toegepast. Tot slot moet worden gezorgd tussen gebruiker variabiliteit in de toepassing van het protocol betreffende. Dergelijke verschillen zijn samengevat in Figuur 5 waar de dezelfde gegevensset werd geanalyseerd door twee onafhankelijke gebruikers een identieke protocol toe te passen, zoals kort samengevat boven.
Extra morfologie gegevens worden bijeengezocht uit afzonderlijke cellen geïsoleerd van de binaire installatiekopieën die zijn gemaakt tijdens de looptijd van het protocol. De stappen van het protocol om te analyseren microglia morfologie voorafgaand aan en het gebruik van de FracLac plugin worden samengevat in Figuur 6. We illustreren deze analyse in beide ongedeerd (figuur 6A) en gewond (figuur 6B) weefsel. Representatieve beelden van binary, overzicht, bolle romp/encapsulating cirkel en vak tellen voorbeelden voor elke cel geanalyseerd met en zonder het protocol toepassing worden weergegeven in Figuur 6 c--F. Deze beelden helpen illustreren de oorsprong van verschillen in morfologie-gegevens die zijn samengevat in figuur 6G.
Figuur 1. Illustraties van skeletonized microglia met een cirkelvormige soma (suboptimaal) versus een gemeenschappelijke oorsprong soma (optimaal) en de bijbehorende overlay tussen de skeletonized cel en de oorspronkelijke gekleurd. Schaal bar = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Protocol van toepassing op fluorescerende photomicrographs. Illustraties van het protocol van de Skeleton analyse toegepast op een fluorescerende gekleurd met een eencellige bijgesneden om details te tonen. Schaal bar = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. De looptijd van het Protocol tot helder-veld DAB photomicrographs. Illustraties van het protocol van de Skeleton analyse toegepast op een heldere-veld DAB gekleurd met een eencellige bijgesneden om aan te tonen van details. Schaal bar = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Data-analyse met en zonder de toepassing van het protocol. (A) een voorbeeld gekleurd van fluorescerende IHC en bijgesneden cel die overeenkomt met het gele vak in (B). Binaire en skeletonized voorbeeldafbeeldingen met (C) en zonder (D) het protocol toegepast zoals beschreven. Samenvattingsgegevens van microglia eindpunten/cel- en proces lengte/cel in ongedeerd (wit) en gewonden van de corticale weefsel (grijs) met (E) en zonder (F) het protocol toegepast. Statistische analyse met behulp van de student t-test en n = 3, ** p < 0.01 duidt. Schaal bar = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5. Verschillen met toepassing van het protocol. Een voorbeeld van een originele afbeelding en protocol conversie naar binair en skelet beelden door gebruiker 1 en 2 van de gebruiker. Verschillen tussen de twee beelden zijn gemarkeerd met gekleurde cirkels bijpassende. Samenvatting grafieken van microglia eindpunten/cel- en proces lengte/celgegevens in ongedeerd en gewonden hersengebieden door gebruiker 1 en 2 van de gebruiker. Statistische analyse met ANOVA en monster grootte is n = 3; p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Schaal bar = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6. Fractal analyse met en zonder de toepassing van het protocol. Voorbeeld van bijgesneden photomicrographs van microglia in de ongedeerd (A) en geblesseerde (B) cortex met bijbehorende binaire (C) en (D) overzicht afbeeldingen waardoor met en zonder het protocol toegepast. De bijbehorende convex omhulsel (blauw) en bijvoeging cirkel (roze) voor overeenkomende overzicht vormen (E) worden gebruikt voor het berekenen van de dichtheid van de vorm, verhouding en cirkelvormigheid (G) omspannen. Het vak tellen methode is geïllustreerd in (F), en gebruikt voor Fractale dimensie (DB) en lacunarity (λ) berekeningen (G). Schaal bar = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Microglia cellen zijn fijn afgestemd op de Fysiologie en pathologie binnen hun micro-domeinen en een breed scala van morphologies-2 weer te geven in zowel subtiele7,14 en bruto letsel8. Het gebruik van ImageJ protocollen microglia morfologie kwantificering toegankelijk maakt voor alle laboratoria als platform en plugins zijn een open-source software voor beeldverwerking. Terwijl het beschreven protocol is gericht op de beeldverwerking en de analyse met behulp van deze software, begint de consistentie van gegevensverzameling, geldigheid en betrouwbaarheid met uitstekende IHC en microscopie. Dit protocol wordt gebruikt om binaire, skelet, en overzicht representaties van de hele photomicrographs en afzonderlijke cellen te verbeteren, maar kan niet de plaats innemen van arme IHC kleuring en microscopie die resulteert in een laag contrast, wazig of vervormd beelden. Als een extra vergoeding, wees voorzichtig niet om plat van het hersenweefsel tijdens opslag, vóór het segmenteren, die onherroepelijk microglia morfologie verandert. Tot slot, binnen elk experiment, microglia moet worden beeld met behulp van dezelfde schaal, evenals de dezelfde Microscoop. Instrumentatie, doelstellingen en software verschillen onder microscopen die zal resulteren in verschillende grootte photomicrographs ondanks soortgelijke doelstellingen en wijzigen van de details, alsmede het aantal cellen binnen elk frame. Beeldacquisitie met behulp van een 40 X-doelstelling op een Leica SPII resulteert bijvoorbeeld in tweemaal het aantal cellen en minder detail dan overname met behulp van een Zeiss-880. Dit is vooral belangrijk voor cel restanten gegevens verzameld uit het gehele frame in plaats van een enkele cel, zoals dit een probleem voor de bemonstering van de gegevens wordt.
In het algemeen, skeleton analyse die gebruik maakt van de hele gekleurd wordt voorafgegaan door de eencellige fractal analyse om twee redenen. Bepalende cel restanten van alle cellen in een gekleurd is snel in vergelijking met de eencellige fractal analyse en kan worden beschouwd als een screening tool als tijd een factor is. Daarnaast worden de binaire afbeeldingen afgeleid tijdens de skeleton analyse gebruikt voor analyse van de fractal. Zodra het beeld, zijn er een aantal essentiële stappen die kunnen beïnvloeden skelet analyseresultaten en de invoering van gebruiker-invloed. Het protocol stappen die meeste variabel tussen gebruikers zijn zijn stap 4.2 (toenemende helderheid van de afbeelding) en stap 4.5 (bepalen van de drempel). Waar mogelijk, is een optimale nummer te verhogen van de helderheid (max of min schuifregelaar tussen 0-255) vastgesteld en constant voor alle afbeeldingen en gebruikers gehouden. Waar beeld variabiliteit groot is, kan de gebruiker in plaats daarvan een helderheid die tussen de afbeeldingen variëren zal kiezen. Als afbeeldingen licht zijn en contrast hoog is, dan meer helderheid kan worden weggelaten en drempelmethode kan worden herleid met behulp van een speciale drempel filter (bv., Huang) in plaats van de meer variabele standaard. Zodra geoptimaliseerd, de parameters moeten in acht worden genomen om het minimaliseren van extra gebruiker-invloed.
Een voorbeeld van de variabiliteit van de gebruiker is opgenomen in afbeelding 5. Gegevenswaarden in gebruiker 1 versus gebruiker 2 werden verhoogd en daarom variabiliteit zou worden verhoogd als zowel gebruiker 1 en 2 van de gebruiker aan het verzamelen van gegevens bijgedragen. Een voorbeeld van de verschillen in gebruiker 1 en gebruiker 2 binaire en skeletonized beelden worden aangegeven met gekleurde cirkels (Figuur 5). In dit geval waren beide gebruikers kort opgeleide studenten met beperkte expertise in microglia. Regelmatig toezicht en begeleiding door een deskundige samen met verhoogde protocol opleiding2 microglia kunnen verminderen tussen gebruiker variabiliteit. Hoewel hier niet beoordeeld, immers fractal analyse minder afhankelijk van Inter gebruiker variabiliteit binaire cellen zijn handmatig en individueel geïsoleerd van een gekleurd in plaats van te vertrouwen alleen op drempelmethode om microglia vormen. Echter bezitten alle methoden sommige variabiliteit tussen de gebruikers. Dus, een enkele gebruiker (in het ideale geval getraind door enkele expertise in microglia cellen) het verzamelen van de gegevens voor een gehele dataset moeten worden voltooid.
Extra wijzigingen kunnen gemakkelijk worden gedaan om dit protocol en beeldkwaliteit, en alles in het werk verminderen lawaai en ervoor zorgen dat proces connectiviteit zal afhangen. Bijvoorbeeld, als contrast voldoende is, dan onscherp masker is niet nodig en kan worden weggelaten. Het is verstandig om te optimaliseren en het protocol voor een specifieke set van beelden, zowel experimentele gevallen en controles, vóór het verzamelen van gegevens uit een hele reeks af te ronden. Tot slot, extra plugins kan worden gebruikt in plaats van anderen te verduidelijken of verscherpen van afbeeldingen die niet werden beschreven in dit protocol zoals verwijden of verscherpen.
Voordelen van dit protocol zijn de universele beschikbaarheid en aanpassingsvermogen. Daarnaast, is beoordeling van de restanten van de cel met behulp van AnalyzeSkeleton snel en van toepassing op een gehele gekleurd. Een voordeel van meerdere cellen analyse aanpak is de focus op een hele regio in plaats van afzonderlijke cellen. Men kan dus snel beoordelen de gemiddelde restanten (in termen van eindpunten en proces lengte) van alle microglia binnen het besturingselement image. Skelet analyse geeft een analyse van meerdere cellen: een steekproef van de gegevens in cel aantallen die niet kunnen worden afgestemd door fractal analyse als gevolg van de investering van de vereiste tijd te isoleren van de afzonderlijke cellen van photomicrographs. Een exemplaar waar dit misschien wel geschikt zou zijn bij bevolkingsonderzoek microglia morphologies in proximities aan een focal verwonding. Een beperking is het hele veld beeldweergave om skelet modellen van IHC photomicrographs is onvolmaakt in vergelijking met de meer tijdrovend eencellige aanpak. Bovendien, is een regio-analyse niet overeenkomen met de omstandigheden waar microglia morphologies zijn drastisch anders binnen hetzelfde veld. Tot slot, deze analysemethode is afhankelijk van aantal cellen, een parameter die tussen experimentele omstandigheden verschillen kan.
Fractal analyse wordt uitgevoerd op een enkele cel en daarom is een aanvulling op de gemiddelde cel restanten gegevens output die voortvloeien uit de skeleton analyse. Hoewel veel meer tijd consumeren, deze investering een breed scala van Morfometrische gegevens levert. Bijvoorbeeld celdichtheid, span-verhouding, en cirkelvormigheid gegevens beschrijven de grootte, rek en vorm van de omtrek van de cel, respectievelijk. Fractale dimensie en lacunarity samen te vatten de cel Complexiteit en heterogeniteit van de vorm, respectievelijk. Een meer diepgaande samenvatting van hoe elke parameter wordt berekend en hoe gegevens kunnen worden geïnterpreteerd wordt verstrekt in de interactieve handleiding16 en zo gedetailleerd moet worden beschouwd met betrekking tot de specifieke onderzoeksvraag. Het beschreven protocol resulteert in gevoelige hulpmiddelen te kwantificeren pasmunten in 2D microglia morphologies die zich in fysiologische en pathologische omstandigheden voordoen kunnen. Extra Morfometrische analyse zoals degelijkheid en convexiteit16,20 van de factor van de vorm wellicht mogelijk als het genereren van 3D-vormen.
Protocol ontwikkeling en aanpassing is continu en gebruikersgerichte. Het is uitgebreid van fluorescentie8 DAB/helder-veld beelden7 , maar nog niet ingesloten weefsel paraffine. Het toevoeging, het kan worden gebruikt in combinatie met propriëtaire software zoals Imaris voor aanvullende analyse. Dit protocol kan worden toegepast op een verscheidenheid van fysiologie en is niet beperkt tot microglia maar naar een cel of een weefsel met bijzondere patronen of vormen die kunnen worden geïdentificeerd met behulp van IHC methoden kan worden toegepast. Tot slot, met voldoende grootte van de steekproef, een experiment met meerdere varianten of cluster analyse kan worden toegepast om te stratificeren microglia volgens morfologie12,21; Dit is nuttige informatie zoals microglia morfologie een belangrijke indicator van microglia functies en reacties op hun omgeving is. De waardering voor microglial morfologische diversiteit is groeiende en het belangrijk dat u volledig begrijpt neuron-glia-vasculaire interacties tijdens gezondheid en ziekte. Groei in dit veld wordt versterkt door goed ontwikkelde, makkelijk te gebruiken en reproduceerbare protocollen te kwantificeren en microglia morfologie met behulp van meerdere continue variabelen samen te vatten.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie kreeg financiële steun van de NINR (F32NR013611). Wij willen verder erkennen en dank de ontwikkelaars van AnalyzeSkeleton(2D/3D) en FracLac (Arganda-Carreras et al. en Karperien et al., respectievelijk) zonder dat de hierin beschreven analyse niet mogelijk zou zijn.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| primary antibody anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | rabbit host |
| Vectashield soft mount | Vector Labs | H-1000 | |
| Secondary antibody | Jackson ImmunorResearch | 711-545-152 | donkey host |
| 4 mL glass vial | Wheaton | UX-08923-11 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma | S-8032 | |
| glass coverslip | Fisher Scientific | 12-544-G |
References
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
- Karperien, A., Ahammer, H., Jelinek, H. F. Quantitating the subtleties of microglial morphology with fractal analysis. Front Cell Neurosci. 7 (3), eCollection (2013).
- Taylor, S. E., Morganti-Kossmann, C., Lifshitz, J., Ziebell, J. M. Rod microglia: a morphological definition. PLoS One. 9 (5), e97096 (2014).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Abiega, O., et al. Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling. PLoS Biol. 14 (6), e1002466 (2016).
- Wyatt-Johnson, S. K., Herr, S. A., Brewster, A. L. Status Epilepticus Triggers Time-Dependent Alterations in Microglia Abundance and Morphological Phenotypes in the Hippocampus. Front Neurol. 8 (700), eCollection (2017).
- Morrison, H., Young, K., Qureshi, M., Rowe, R. K., Lifshitz, J. Quantitative microglia analyses reveal diverse morphologic responses in the rat cortex after diffuse brain injury. Sci Rep. 7 (1), 13211 (2017).
- Morrison, H. W., Filosa, J. A. A quantitative spatiotemporal analysis of microglia morphology during ischemic stroke and reperfusion. J Neuroinflammation. 10 (4), (2013).
- Gyoneva, S., Traynelis, S. F. Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors. J Biol Chem. 288 (21), 15291-15302 (2013).
- Xu, H., et al. Environmental Enrichment Potently Prevents Microglia-Mediated Neuroinflammation by Human Amyloid beta-Protein Oligomers. J Neurosci. 36 (35), 9041-9056 (2016).
- Rodriguez, J. J., Noristani, H. N., Verkhratsky, A. Microglial response to Alzheimer's disease is differentially modulated by voluntary wheel running and enriched environments. Brain Struct Funct. 220 (2), 941-953 (2015).
- Soltys, Z., et al. Quantitative morphological study of microglial cells in the ischemic rat brain using principal component analysis. J Neurosci Methods. 146 (1), 50-60 (2005).
- Orlowski, D., Soltys, Z., Janeczko, K. Morphological development of microglia in the postnatal rat brain. A quantitative study. Int J Dev Neurosci. 21 (8), 445-450 (2003).
- Morrison, H. W., Filosa, J. A. Sex differences in astrocyte and microglia responses immediately following middle cerebral artery occlusion in adult mice. Neuroscience. 339, (2016).
- Arganda-Carreras, I., Fernandez-Gonzalez, R., Munoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. 3D reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue. Microsc Res Tech. 73 (11), 1019-1029 (2010).
- Karperien, A. FracLac for ImageJ. , Available from: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/fraclac/FLHelp/Introduction.htm (2013).
- Davis, B. M., Salinas-Navarro, M., Cordeiro, M. F., Moons, L., De Groef, L. Characterizing microglia activation: a spatial statistics approach to maximize information extraction. Sci Rep. 7 (1), 1576 (2017).
- Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ (2014).
- Karperien, A. L., Jelinek, H. F., , Fractal, Multifractal, and Lacunarity Analysis of Microglia in Tissue Engineering. Front Bioeng Biotechnol. 3 (51), eCollection (2015).
- Martyanova, E. K., Tishkina, A. O. 3D quantitative analysis of microglial morphology. available as conference preceedings SkoltechOn. , (2015).
- Fernandez-Arjona, M. D. M., Grondona, J. M., Granados-Duran, P., Fernandez-Llebrez, P., Lopez-Avalos, M. D. Microglia Morphological Categorization in a Rat Model of Neuroinflammation by Hierarchical Cluster and Principal Components Analysis. Front Cell Neurosci. 11 (235), eCollection (2017).
