Summary
Microglia er hjernen immunceller som undersøkelse og reagere på endrede hjernen fysiologi gjennom morfologiske endringer som kan evalueres kvantitativt. Denne protokollen beskriver en ImageJ basert analyse-protokollen for å representere microglia morfologi som kontinuerlig data etter beregninger som cellen forgrening, kompleksitet og form.
Abstract
Microglia er hjernen phagocytes som deltar i hjernen homeostase og kontinuerlig undersøkelse miljøet for dysfunksjon, skader og sykdom. Som de første responders, microglia har funksjonene å redusere Nevron og glia dysfunksjon, og i denne prosessen de gjennomgå en rekke morfologiske endringer. Microglia morphologies kan kategoriseres urzywac, eller alternativt kan kvantifiseres som en kontinuerlig variabel for parametere som cellen forgrening, kompleksitet og form. Mens metoder for kvantifisering av microglia brukes på enkeltceller, gjelder noen teknikker for flere microglia i en hel photomicrograph. Formålet med denne metoden er å tallfeste flere og enkeltceller bruker tilgjengelige ImageJ protokoller. Denne protokollen er en oppsummering av trinnene og ImageJ plugins konvertere fluorescens og lyse-feltet photomicrographs til representant binære og skeletonized bilder og analysere dem bruker programvare plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D) og FracLac for morfologi datainnsamling. Resultatene av disse plugins oppsummere celle morfologi prosessen endepunktene, veikryss, og lengde samt kompleksiteten, celle form og størrelse beskrivelsene. Skjelett analyse protokollen beskrevet her er godt egnet for en regional analyse av flere microglia i en hel photomicrograph eller region av interesse (ROI) mens FracLac gir en utfyllende enkeltcelle analyse. Kombinert, gir protokollen en objektiv, følsom, og omfattende vurdering verktøy som kan brukes til å stratify mellom ulike microglia morphologies i hjernen sunn og skadet.
Introduction
Microglia har en umiddelbar og mangfoldig morfologiske respons til endringer i hjernen fysiologi1 langs et kontinuum av muligheter som spenner fra hyper-konsekvenser og komplekse morphologies til de ramified og amoeboid morphologies2 . Microglia kan også bli polarisert og stav-formet3. Microglia celle konsekvenser er vanligvis definert som en kompleks figur har flere prosesser og rapporteres ofte som antall endepunkter per celle og lengden på celleprosesser. Siden microglia er fininnstilt til nevronale og glial funksjonen til kontinuerlig celle-celle cross-talk og i vivo motilitet4,5, kan microglia morphologies tjene som indikatorer på ulike celle funksjoner og dysfunksjoner i hjernen. En kvantitativ tilnærming er nødvendig å yte mangfoldet av endringene morfologiske og skille forskjellene blant ramified celler som oppstår med subtile fysiologiske forstyrrelser (for eksempel epilepsi5,6 og hjernerystelse7) i tillegg til brutto skade (for eksempel strek8). Økt bruk av morfologi kvantifisering7,8,9,10,11,12,13,14 vil avdekke hele mangfoldet av microglia morphologies i helse og sykdom. Denne studien detaljer gradvis bruk av ImageJ plugins nødvendig å oppsummere microglia morfologi fluorescent eller ikke-fluorescerende photomicrographs av microglia ervervet i fast gnager vev etter immunohistochemistry (IHC).
Sentralt til analyseteknikker beskrevet her er ImageJ plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D)15, utviklet i 2010 å kvantifisere store mammary strukturer, og FracLac16, utviklet i 2014 å integrere ImageJ og fraktal analyse kvantifisere personlige microglia figurer. Disse plugins gir en rask analyse av microglia konsekvenser i hele photomicrographs eller flere microglia for en definert avkastning innenfor en photomicrograph. Denne analysen kan brukes alene eller supplement med fraktal analyse. Encellede fraktal analyse (FracLac) krever en investering av tid, men gir flere morfologi utganger om microglia kompleksitet, form og størrelse. Bruk av begge verktøy er ikke redundant, som cellen forgrening er utfyllende til celle kompleksitet og kombinasjonen av flere parametere som kan brukes til å skille mellom ulike microglia morphologies i datasett12,17.
Protocol
Alle eksperimentene ble godkjent av og samsvar med retningslinjene som er fastlagt ved University of Arizona institusjonelle dyr omsorg og bruke komité og NIH retningslinjene og bruk av forsøksdyr. Care ble tatt for å minimere dyr smerte og ubehag. Eutanasi metoder er ifølge en godkjent protokoll og består av cervical halshogging under isoflurane anestesi.
1. vev forberedelse
Merk: Utfør microglia morfologi analyse på fast cryoprotected vevsprøver beholde celle morfologi. Følgende er en standardprotokoll for å forberede og direkte skjær fast vev til fluorescens IHC.
- Fjern mus eller rotte hjernen fra en euthanized dyr etter ønsket eksperimentet og etter en standard laboratorium protokoll. Plass hjernen i 10 mL ampuller som inneholder 5 mL av en 4% paraformaldehyde løsning for 24 timer på 4 ° C. Skyll og sted i 5-10 mL av en 30% sukrose fosfat bufret løsning (PBS, 0,01 M) for 72 h på 4 ° C. Lagre hele hjernen på-80 ° C til vev snitting med en kryostaten eller på 4 ° C hvis snitting med en mikrotom.
Merk: Denne protokollen har ennå ikke blitt testet ved hjelp av vev skiver fra parafin-embedded vev. - Delen hjernevev til ønsket snittykkelse og retning bruker kryostaten eller mikrotomen og store frittflytende inndelinger i en cryoprotection løsning (50 mM PBS, ethylene glycol, glyserol) på 20 ° C.
Merk: Denne protokollen er vellykket utført på koronale vev deler alt fra 50 µm til 200 µm tykkelse. Vev seksjoner mindre enn 50 µm ikke kan fange at full microglia prosesser, mens i tykk vev deler, IHC flekker kan være imperfektum på grunn av antistoff gjennomtrengning i vev. Dette valget vil avhenge av eksperimentelle mål og hjernen områdene studier vev kan være inndelte enten i en Koronal eller sagittal.
2. Immunohistochemistry
Merk: Skjelettet og fraktal dataanalyse metoder kan brukes til fluorescens eller 3, 3-diaminobenzidine (DAB) IHC. Følgende er en standard fluorescens IHC protokoll og kan erstattes etter behov. Fluorescens IHC gir overlegen visualisering av celleprosesser sammenlignet med DAB IHC.
- Plasserer delene vev i en 4 mL hetteglass (opptil 15 musen hjernen deler/medisinglass) og ruge med 1 mL løsningen inneholder opp til 10% hest serum, PBS (0,01 M), 0,5% Triton, 0,04% NaN3 ved romtemperatur (23 ° C) 1t.
- Vask i 5 min med PBS (0,01 M) tre ganger i romtemperatur.
- Inkuber med det primære antistoffet (Iba1, 1:1, 000) ved romtemperatur for 72 timer i 1 mL av løsning som inneholder PBS (0,01 M), 0,5% Triton, 0,04% NaN3, og dekket (Hvis du vil beholde NaN3 effektiviteten).
- Vask i 5 min med PBS (0,01 M) tre ganger i romtemperatur.
- Inkuber med sekundær antistoffer (anti-kanin 488, 1:250) dekket ved romtemperatur 4 h i 1 mL av løsning som inneholder PBS (0,01 M), 0,5% Triton, 0,04% NaN3
- Vask i 5 min med PBS (0,01 M) tre ganger i romtemperatur.
- Montere delene hjernen vev (nummer og retning basert på preferanse) subbed lysbilder, bruk en myk-sett montering medium på lysbildet og sted dekkglassvæske over vevet. Lagre lysbilder på 4 ° C.
Merk: 1,5 glass dekkglassvæske tykkelse kreves for AC confocal bildebehandling. Soft-sett er en foretrukket montering medium fordi den høy viskositeten ikke komprimere vev og beste beholder morfologi sammenlignet med hard-set monterer medier.
3. imaging
- Bilde Iba1 positive cellene i hjernen vev delen bruke lyse-feltet eller AC confocal mikroskop som har en z-stack oppkjøpet kompetanse ved hjelp av en 20 X mål eller større.
Merk: Imaging parametere og programvaren oppsett må være konstant for alle photomicrograph oppkjøp i et eksperiment. Utmerket prosessinformasjon oppnås med en 40 X eller 63 X mål. Det er mulig å bruke skjelett analyse protokollen beskrives her en hel photomicrograph eller en flercellet avkastning innen en større photomicrograph.- Hente 8-biters bilder ved hjelp av riktig programvare innstillingene gjelder for mikroskop programvaren.
Merk: Konvertering av filer til 8-biters etter oppkjøp kan forvrenge datainnsamling. - Få minst 30 µm z stabel med ikke mer enn en 2 µm intervall mellom bilder ved hjelp av riktig programvare innstillingene gjelder for mikroskop programvaren.
Merk: Den mikroskop og programvare bør tillate bildeopptak i en X-, Y- og Z-aksen. Z stabel kan økes, og intervallet kan reduseres for å gi ekstra microglia detaljer. I bytte, vil imaging tid øke. Bruk Nyquist prøvetaking der det er mulig for fluorescens mikroskopi.
- Hente 8-biters bilder ved hjelp av riktig programvare innstillingene gjelder for mikroskop programvaren.
- Lagre alle filer som Tif-filer eller som kreves av mikroskopet.
- Åpner Tif-filer i ImageJ og bruke verktøylinjen til å dele kanaler ved å klikke bilde | Farge | Del opp kanaler, og stakk bilder ved å klikke bilde | Stabler | X prosjekt | Maksimal intensitet projeksjon nødvendig. Lagre som TIF-filer.
4. skjelett analyse
- FIJI eller ImageJ fra < https://imagej.net/Fiji/Downloads>. Enkelte plugins, laste ned AnalyzeSkeleton(2D/3D) fra < http://imagej.net/AnalyzeSkeleton>15 og laste ned FracLac fra < https://imagej.nih.gov/ij/plugins/fraclac/fraclac.html>16.
Merk: Hele prosessen med å konvertere en photomicrograph til en binær skeletonized bilde tar mindre enn 1 min. - Hvis bruker en fluorescens photomicrograph, kontroller bildet er 8-bits og konvertere til gråtoner beste visualisere alle positiv flekker. Bruke verktøylinjen og klikk bilde | Oppslagstabeller | Grå. Hvis bruker en DAB lyse-feltet fotografi, første bruk FFT Båndpassdesign filter plugin (ved hjelp av verktøylinjen ved å klikke prosess | FFT | båndpassfilter) og deretter konvertere til gråtoner.
Merk: I forbindelse med denne protokollen, ImageJ standardinnstillingene for en FFT båndpassfilter er tilstrekkelig (filter til 3 piksler, ned 40, ingen stripe undertrykkelse). Bruke en FFT båndpassfilter fjerner støy (små funksjoner) samtidig bevare generelt større deler av bildet. Dette er spesielt nyttig i lyse feltet bilder der deler og sprekker i vevet kan vises som bakgrunn og dermed kompliserer skjelett analyse18. - Justere lysstyrken og kontrasten hvis bildet er for svak og microglia prosessen kan visualiseres. Bruke verktøylinjen og klikk bilde | Justere | Lysstyrke/kontrast. Juster skyvekontrollene minimums- eller maksimumsverdien nødvendig kantene av histogrammet men ingen ytterligere.
Merk: I ImageJ, lysstyrke og kontrast endret ved å oppdatere bildets oppslagstabellen (LUT), så bildepunktverdiene er uendret. Max og min glidere kontrollere nedre og øvre grensene i displayet området, med pixel-verdier over 255 vises hvite- og bildepunktverdier under 0 vises svart18. Ved fluorescens photomicrographs, skal maksimal glidebryteren brukes mens glidebryteren minimum skal brukes for photomicrographs av DAB farget microglia. - Kjøre et uskarpt-filteret for å øke kontrasten ved hjelp av verktøylinjen ved å klikke prosess | Filtre | Uskarp maske. I forbindelse med denne protokollen, Imagejs standardinnstillinger (en piksel radius av 3 og maskere vekt på 0,6) brukes.
Merk: Uskarp maske gjør skarpere og forbedrer funksjonene kanten av et bilde ved å trekke en uskarpe versjon av bildet (Uskarp maske) fra opprinnelige, og slå det resulterende bildet med en høy kontrast versjon av det opprinnelige bildet. Derfor filtret skaper ikke detaljene, men heller tydeliggjør den eksisterende detaljene i et bilde. Radius innstillingsendringer hvor uskarpe Uskarp maske vil bli (og dermed hvor mye uskarphet fjernes), og maske vekten innstillingsendringer graden av kontrast som Uskarp maske skal flettes med (og dermed justerer kontrasten i det endelige bildet). - Utfør en flekkfjerning trinn for å fjerne salt-and-pepper støy generert av Uskarp maske. Bruke verktøylinjen og klikk prosess | Støy | Støvfjernar.
Merk: Støvfjernar fjerner salt-and-pepper støy ved å erstatte hver piksel med medianverdien i sin 3 × 3 nabolaget. Effekten er at outliers intensitet erstattes piksel median uten at det påvirker skarpheten på kantene18. - Konverter bildet til binær bruke verktøylinjen ved å klikke bilde | Justere | Terskelen.
Merk: Terskelverdi stratifies av gråtonebilder til funksjoner av interesse mot bakgrunnen og konverterer bildet til binære18. - Bruke flekkfjerning, nær-, og fjerne outliers funksjoner: I den resulterende binær image, det kan være enkelt piksel bakgrunnsstøy og gapene mellom prosesser.
- Bruke funksjonen flekkfjerning bruke verktøylinjen ved å klikke prosess | Støy | Støvfjernar.
Merk: Bruk Støvfjernar til binærfilen bilde fjerner eventuelle gjenværende single-pixel støy. - Bruk funksjonen Lukk bruke verktøylinjen ved å klikke prosess | Binær | Lukk.
Merk: Denne plugin kobler to mørke piksler hvis de er atskilt med opptil 2 piksler. - Bruke funksjonen for Fjern-outliers bruke verktøylinjen ved å klikke prosess | Støy | Fjerne Outliers.
Merk: I forbindelse med denne protokollen, lyse outliers er rettet med en piksel radius 2 og en terskel på 50. Dette programtillegget erstatter en lys eller mørk avvikende piksel ved median bildepunktene i området hvis den avviker med mer enn en bestemt verdi (terskel)18.
- Bruke funksjonen flekkfjerning bruke verktøylinjen ved å klikke prosess | Støy | Støvfjernar.
- Lagre bildet som en egen fil for fremtidig bruk og/eller fraktal analyse og skeletonize bildet med verktøylinjen ved å klikke prosessen | Binær | Skeletonize.
- Velg skeletonized bildet og Kjør plugin AnalyzeSkeleton(2D/3D) bruke verktøylinjen ved å klikke Plugins | Skjelettet | Analysere skjelett, og merker av for avslaget informasjonen.
Merk: Det er sannsynlig at bildekvalitetsfunksjonene vil kreve optimalisering med tillegg eller sletting av foreslått ovenfor. I denne prosessen vurderes skeletonized bilder for nøyaktighet ved å opprette en overlapping av skjelettet og originalbildet. Somas bør være enkelt opprinnelse poeng med prosesser fra midten. sirkulære somas forvirre dataene og bør unngås gjennom protokollen justering. Et eksempel på en enkelt nullpunktet versus sirkulære somas er illustrert i figur 1.
Vanlige problemer som resulterer i ikke-representative skjeletter og foreslåtte løsninger:
- Bilde for dim: konvertere til gråskala, justere lysstyrke/kontrast glidere eller bruke Uskarp maske
- For mye bakgrunn: justere lysstyrke/kontrast glidere, bruke flekkfjerning eller fjerne outliers
- Sirkulære somas i skeletonized bilde (spesielt for fluorescens bilder): bruke FFT båndpassfilter, og/eller Uskarp maske
- Sprekker i vev (spesielt for lyse-feltet bilder): bruke FFT båndpassfilter, og/eller fjern smårusk
- Kopier alle dataene fra resultatene og grenen ut og lime inn data i et Excel-regneark.
- I Excel kan du kutte dataene for å fjerne skjelett fragmenter som følge av IHC og bilde.
- Kopiere eksperiment arbeidsboken med rådata utdataene fra skjelett analyse og legge til TRIM i filnavnet. Alle etterfølgende data trimming skal oppstå i kopierte arbeidsboken beholde rådataene for fremtidig bruk og referanse.
- Bestemme hvilke lengden av fragmenter vil bli beskåret fra datasettet ved åpning skeletonized bildet i ImageJ og velge linjeverktøyet. Måle flere fragmenter, tar notat av gjennomsnittlig lengde, og bestemme om en avkuttet verdi.
Merk: I forbindelse med dataene som presenteres her, cutoff lengden for uønskede fragmenter er 0,5. Denne verdien må være konsekvent for et dataset. - Egendefinert sortere Excel-regnearket ved å klikke Sorter og Filtrer | Sorteringsrekkefølger. Sorter etter "endepunkt voxels" fra størst til minst og et nytt nivå, av "Mx gren pt" fra største til minste.
- Fjerne hver rad som inneholder 2 endepunktene med en maksimal gren lengde mindre enn denne verdien (i.e., 0,5). Summere dataene i kolonnen endepunktene til å beregne antall endepunkter samlet fra bildet.
- Gjenta for grenen informasjonsdata: sortere etter lengde for gren fra største til minste. Bla gjennom dataene og fjerne hver rad har en gren lengde mindre enn denne verdien(i.e., 0,5). Summere verdiene i kolonnen gren lengde beregne summerte lengden av alle grener fra bildet.
- Gjenta trinn 4.11.3-4.11.5 for hvert bilde/ark til alle data har blitt trimmet og summert.
- Dele dataene fra hvert bilde (oppsummerte antall endepunkter og oppsummerte lengden for gren) av antall microglia somas i tilsvarende bildet. Angi de endelige dataene (endepunktene/celle & gren lengde/celle) i statistisk programvare.
Merk: Summerte gren lengde/celledataene krever konvertering fra lengde i piksler til mikron.
5. fraktal analyse
Merk: FracLac er i stand til å kjøre en rekke forskjellige form analyser som ikke dekkes i denne protokollen. For en mer detaljert forklaring av FracLac er ulike funksjoner, se håndboken til FracLac på < https://imagej.nih.gov/ij/plugins/fraclac/FLHelp/Introduction.htm> og tilknyttede referanser 2,16,19. Fraktal analyse benytter protokollen trinnene 4.1-4.7 beskrevet ovenfor.
- Bestemme størrelsen av Avkastningen som skal brukes for alle fraktal analyse. Bruk Rektangelverktøy til å tegne Avkastningen. Kontroller at boksen er stor nok til å fange opp hele cellen og kan være konsekvent på hele datasettet.
Merk: Bruk rektangel i stedet for Frihånd valget for å sikre at alle ROIs er samme størrelse rektangelet, og derfor cellene har samme skala. Dette ville ikke være tilfelle hvis Frihånd utvalget ble brukt fordi ImageJ Autoskaler en firkantet avkastning å passe ulike store rektangulære Vinduer resulterer i celler i en annen skala. Mens fraktal er uavhengig av skalaen, er fraktal analyseprosessen med FracLac for ImageJ avhengig av skala16. Dermed er det behov for en konsekvent størrelse avkastning gjennom datainnsamling. - Tilfeldig velge microglia for fraktal analyse i hver photomicrograph og tilhørende binære bilder. Velg oppdateringen låse Avkastningen på cellens plassering i Avkastningen manager-vinduet. Bruk Ctrl + Skift + D kopiere området i Avkastningen som et nytt vindu, og deretter lagre beskjæres cellen. På tilsvarende binære bildet (fra skjelett analyse), duplisere området med samme celle med Avkastningen manager. Gjenta til et tilstrekkelig antall celler er tilfeldig valgt for fraktal analyse og lagre alle filer.
Merk: En tilfeldig tall generator og et nummerert rutenett kan brukes til tilfeldig velge celler. - Åpne binære bildet med personlige cellen. Dobbeltklikk pensel verktøyet, sette fargen til svart, og justere pensel bredden etter behov. Bruke den samsvarende photomicrograph som referanse, bruke pensel fjerne nabocelle prosesser, koble til fragmentert prosesser og isolere cellen rundt. Når binære cellen er isolert, lagre den binære filen.
Merk: Holde "alt" vil slå pensel fra forgrunnsfargen (svart) til bakgrunnsfarge (hvit). - Konvertere binære cellen til en disposisjon ved hjelp av verktøylinjen via prosess | Binær | Disposisjon.
Merk: FracLac for bildet J kan brukes på enten solid figurer eller figuren skisserer, men gjeldende konvensjonen er bruke figur skisserer16. - Åpne FracLac ved hjelp av verktøylinjen ved å klikke Plugins i verktøylinjen | Fraktal analyse | FracLac og velg BC (boksen teller). Angi Num G i innstillingene for Rutenett Design , til 4. Merk beregninger for å analysere konvekst skrog og markeringsrammen sirkel av cellen under grafikk alternativer. Når ferdig, velg OK.
Merk: Num G er antall boksen teller rutenettet orientering brukes under skanningen og anbefalt område for Num G 4-12. Innstillingen for Num G og det foreslåtte området vurderes nøye i FracLac manuell16. Økende Num G kan betydelig redusere ganger. FracLac innstillingene må bare defineres én gang per økt. Når innstillingene er angitt, blir Skann-knappen tilgjengelig. - Velg Skann til gjennomsøk boksen-telling på valgt bilde.
Merk: Skanningen vil generere tre vinduer med data utganger: skroget og sirkel resultater, boksen antall Sammendrag fil og skanne typer. Skanne typer-vinduet inneholder en logg over innstillingene som brukes, så vel som standard avvik for bestemte måler. I forbindelse med denne protokollen, kan skanne typer-vinduet ikke brukes og være lukket eller lagret for fremtidig referanse. - I vinduet Hull og Sirkel resultater kopiere alle ønskede data (dvs., tetthet og span forholdet sirkularitet) resultater. I vinduet Boksen antall Sammendrag kopiere ønskede data (dvs., fraktal dimensjon og lacunarity) resultater. Overføre de kopierte dataene til en Excel-fil eller statistisk programvare.
Merk: En fullstendig liste over FracLac output data er gitt og grundig forklart i FracLac for manuell ImageJ-16.
Representative Results
Microglia morfologi analyse protokoller beskrevet her oppsummere trinnene nyttig fluorescerende og DAB photomicrographs for morphometric analyse. Følgende oppsummeres visuelt i figur 2 og Figur 3. Målet med denne fremgangsmåten er å skape et representativt binær og skeletonized bilde som hensiktsmessig modeller det opprinnelige photomicrograph slik at de sammenlagte dataene er gyldige. Etter protokollen søknad, AnalyzeSkeleton plugin resulterer i et kodet skjelett bilde som antall endepunkter og gren (dvs., behandle) lengthcan oppsummeres fra resulterende utdatafiler. Sluttpunkt og prosessen lengde data brukes deretter til å beregne omfanget av microglia konsekvenser i photomicrograph eller avkastning. Figur 4 oppsummerer resultatdataene (endepunktene/mobiltelefon og prosessen lengde/celle) samlet med og uten programmet protokollen. Mens lignende trender finnes, er dataene oppsummert i figur 4F varierte mindre enn de i figur 4E. i tillegg disse dataene illustrere økt følsomhet for å oppdage forskjeller mellom gruppene når protokollen brukes. Til slutt må utvises om Inter bruker variasjoner i anvendelsen av protokollen. Slike forskjeller er oppsummert av figur 5 der samme datasettet ble analysert av to uavhengige brukere bruke en identisk protokoll slik ovenfor.
Ekstra morfologi data er samlet inn fra enkeltceller isolert fra binære bilder opprettet under programmet protokollen. Protokollen fremgangsmåten til å analysere microglia morfologi før og bruker FracLac plugin oppsummeres i figur 6. Vi illustrerer denne analysen i begge uskadet (figur 6A) og skadet (figur 6B) vev. Representant bilder av binær, skissert, konveks skrog/ESP sirkel og eksempler på telling for hver celle analysert med og uten protokollen programmet vises i figur 6C-F. Disse bildene hjelpe for å illustrere opprinnelsen til forskjeller i morfologi dataene som er oppsummert i figur 6G.
Figur 1. Illustrasjoner av skeletonized microglia med en sirkulær soma (suboptimal) versus en enkelt opprinnelse soma (optimalt) og tilsvarende overlappingen mellom skeletonized cellen og den opprinnelige photomicrograph. Skala bar = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Protokollen programmet fluorescerende photomicrographs. Illustrasjoner av skjelettet analyse protokollen på en fluorescerende photomicrograph med en enkeltcelle beskåret for å vise detaljer. Skala bar = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Protokollen programmet lyse-feltet DAB photomicrographs. Illustrasjoner av skjelettet analyse protokollen på en lys-feltet DAB photomicrograph med en enkeltcelle beskjæres for å vise detaljer. Skala bar = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Dataanalyse med og uten programmet protokollen. (A) en eksempel photomicrograph fluorescerende IHC og beskjæres cellen svarer til den gule boksen med (B). Eksempel binær og skeletonized bilder med (C) og uten (D) protokollen brukes som beskrevet. Sammendragsdata microglia endepunkt/mobiltelefon og prosessen lengde/cellen i uskadet (hvit) og skadet (grå) kortikale vev med (E) og uten (F) protokollen brukes. Statistisk analyse ved hjelp av student t-test og n = 3, ** angir p < 0,01. Skala bar = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Brukeren forskjeller med protokollen program. Et eksempel på en original image og protokollen konvertering til binær og skjelett bildene av bruker 1 og bruker 2. Forskjeller mellom de to bildene er merket med matchende sirkler. Sammendrag grafer av microglia endepunkt/mobiltelefon og prosessen lengde/celledata i uskadet og skadet hjernen regioner av bruker 1 og bruker 2. Statistisk analyse med ANOVA og prøven størrelsen er n = 3; p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Skala bar = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Fraktal analyse med og uten programmet protokollen. Eksempel på beskjæres photomicrographs av microglia i uskadet (A) og skadet (B) cortex med tilsvarende binære (C) og disposisjon (D) bilder som følge med og uten protokollen brukes. Det tilknyttede konvekst skroget (blå) og kapsle sirkel (rosa) for tilsvarende disposisjon figurer (E) brukes til å beregne form tetthet span forhold og sirkularitet (G). Boksen telling metoden er illustrert i (F), og brukes for fraktal dimensjon (DB) og lacunarity (λ) beregninger (G). Skala bar = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Microglia celler er fininnstilt til fysiologi og patologi innenfor mikro-domenene og viser en rekke ulike morphologies2 i både subtile7,14 og brutto skade8. Bruk av ImageJ protokoller gjør microglia morfologi kvantifisering tilgjengelig for alle laboratorier som plattform plugins er en åpen kildekode bildebehandling. Mens beskrevet protokollen er fokusert på bildebehandling og analyse ved hjelp av denne programvaren, begynner konsistensen av datainnsamling, holdbarhet og pålitelighet med utmerket IHC og mikroskopi. Denne protokollen brukes til å forbedre binær, skjelettet og disposisjon representasjoner av hele photomicrographs og enkeltceller men kan ikke ta plassen til dårlig IHC flekker og mikroskopi som resulterer i lav kontrast, uskarpt eller forvrengte bilder. Som tas med, må være forsiktig å flate ut hjernevev under lagring før snitting som ugjenkallelig endrer microglia morfologi. Til slutt, i hvert eksperiment, microglia må avbildes bruke samme skala som samme mikroskopet. Instrumentering, mål og programvare varierer blant mikroskop som vil resultere i forskjellige størrelse photomicrographs til tross for lignende målsettinger og endre detaljene samt antall celler i hver ramme. For eksempel resulterer bildeopptak bruker en 40 X målet på en Leica SPII i dobbelt så mange celler og mindre enn oppkjøpet bruker en Zeiss 880. Dette er spesielt viktig for celle forgrening data samlet fra hele rammen i stedet for en enkeltcelle som dette blir en sak av data prøvetaking.
Generelt, foran skjelett analyse som benytter det hele photomicrograph enkeltcelle fraktal analyse av to grunner. Bestemme cellen forgrening av alle celler i en photomicrograph er rask når sammenlignet med enkelt celle fraktal analyse og kan betraktes som en screening verktøyet hvis tid er en faktor. I tillegg brukes de binære bildene under skjelett analyse for fraktal analyse. Når fotografert, er det en rekke viktige tiltak som kan påvirke skjelett analyseresultater og presentere brukeren-innflytelse. Protokollen trinnene som er høyst variabel mellom brukere er trinn 4.2 (økende bildelysstyrke) og trinn 4.5 (bestemme terskelen). Der det er mulig, er et optimalt antall å øke lysstyrken (maks eller min glidebryteren mellom 0-255) bestemt og holdes for alle bilder og brukere. Hvor bildet variasjon er stor, kan brukeren i stedet velge en lysstyrke som vil variere mellom bilder. Alternativt, hvis bilder er lyse og kontrast er høy, så øker lysstyrken kan utelates og terskelverdi kan standardiseres ved hjelp av en spesialitet terskelen filter (f.eks., Huang) i stedet for mer variabel standard. Når optimalisert, bør parameterne følges for å minimere flere bruker-innflytelse.
Et eksempel på brukeren variasjon vises i figur 5. Dataverdier økte i bruker 1 versus bruker 2 og derfor variasjon vil økes hvis både bruker 1 og bruker 2 bidratt til datainnsamling. Et eksempel på forskjeller i bruker 1 og bruker 2 binær og skeletonized bilder er markert med sirkler (figur 5). I dette tilfellet var både brukere kort kvalifiserte studenter med begrenset ekspertise innen microglia. Regelmessige tilsyn og veiledning av en microglia ekspert økt protokoll trening2 kan redusere mellom brukeren variasjon. Selv om ikke vurdert her, er fraktal analyse mindre avhengig mellom brukeren variasjon fordi binære celler er manuelt og individuelt isolert fra en photomicrograph i stedet for å stole utelukkende på terskelverdi til å fastslå microglia figurer. Alle metodene har imidlertid noen variasjon mellom brukere. Derfor en enkeltbruker (ideelt sett trent av noen ekspertise i microglia celler) skal fullføre datainnsamling for en hele datasettet.
Ytterligere endringer kan lett gjøres til denne protokollen, og avhengig av bildekvalitet og innsats tatt for å redusere støy og sikre forarbeide tilkoblingen. For eksempel hvis kontrast er tilstrekkelig, deretter Uskarp maske er ikke nødvendig og kan utelates. Det er forsvarlig å optimalisere og fullføre protokollen for et bestemt sett med bilder, både eksperimentelle tilfeller og kontroller, før du samler inn data fra et helt sett. Endelig ekstra plugins kan brukes i stedet for andre å klargjøre eller skjerpe bilder som ikke er beskrevet i denne protokollen som dilate eller skarphet.
Fordelene med denne protokollen er den universelle tilgjengelighet og tilpasningsevne. I tillegg er vurdere celle forgrening bruker AnalyzeSkeleton rask og gjelder for en hel photomicrograph. En fordel med flercellede analyse tilnærming er fokus på en hel region i stedet for enkeltceller. Derfor er det mulig å raskt vurdere den gjennomsnittlige forgrening (i form av sluttpunkt og prosessen lengde) av alle microglia i bildet. Skjelett analyse gir en analyse av flere celler: en datastikkprøver i cellen tallene som ikke samsvarer med fraktal analyse på grunn av tiden investeringen å isolere enkeltceller fra photomicrographs. En forekomst der dette kan være best egnet ville være i screening microglia morphologies i proximities til en fokal skade. En begrensning er hele feltet bildegjengivelse å lage skjelett modeller av IHC photomicrographs er ufullkommen sammenlignet med den mer tidkrevende enkeltcelle tilnærmingen. I tillegg er en regionen analyse ikke riktig forhold der microglia morphologies er drastisk ulike innenfor feltet. Endelig er dette analysemetode avhengig av celletall, en parameter som kan variere mellom eksperimentelle forhold.
Fraktal analyse er gjennomført på en enkelt celle og utfyller derfor gjennomsnittlig celle forgrening data utdataene fra skjelett analysen. Selv om mye mer tidkrevende, denne investeringen gir et bredt spekter av morphometric data. For eksempel celle tetthet, span forhold, og sirkularitet data beskriver størrelse, forlengelse og formen på cellen disposisjonen, henholdsvis. Fraktal dimensjon og lacunarity oppsummerer celle kompleksiteten og figur heterogenitet, henholdsvis. En mer detaljert oversikt over hvordan hver parameter beregnes og hvordan dataene skal tolkes tilbys i de interaktive manuelle16 og slike detaljer bør vurderes i forhold til bestemte problemstillingen. Beskrevet protokollen gir sensitive verktøy å kvantifisere små endringer i 2D microglia morphologies som kan oppstå i fysiologiske og patologisk. Ytterligere morphometric analyse som soliditet og konveksitet form faktor16,20 kan være mulig hvis genererer 3D-figurer.
Protokollutvikling og tilpasning er kontinuerlig og bruker-drevet. Det har blitt utvidet fluorescens8 til DAB/lys-feltet bilder7 men ikke parafinen innebygde vev. Det tillegg, den kan brukes sammen med navnebeskyttet programvare som Imaris for ytterligere analyse. Denne protokollen kan brukes til en rekke fysiologi og er ikke begrenset til microglia men kan brukes på alle celler eller vev med bestemt mønster eller figurer som kan identifiseres ved hjelp av IHC metoder. Til slutt, med tilstrekkelig utvalgsstørrelsen, en multivariabel eller klynge analyse kan brukes for å stratify microglia etter morfologi12,21; Dette er meningsfull informasjon som microglia morfologi er en viktig indikator microglia funksjoner og svar til sine omgivelser. Styrkingen for microglial morfologiske mangfold er voksende og viktig å forstå Nevron-glia-vaskulær interaksjoner i helse og sykdom. Vekst i dette feltet er forbedret med godt utviklet, brukervennlig og reproduserbar protokoller å kvantifisere og oppsummere microglia morfologi ved hjelp av flere sammenhengende variabler.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne studien mottatt økonomisk støtte fra NINR (F32NR013611). Vi ønsker å erkjenne og takke utviklerne av AnalyzeSkeleton(2D/3D) og FracLac (Arganda-Carreras et al. og Karperien et al., henholdsvis) uten som analysen beskrevet her ville ikke være mulig.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| primary antibody anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | rabbit host |
| Vectashield soft mount | Vector Labs | H-1000 | |
| Secondary antibody | Jackson ImmunorResearch | 711-545-152 | donkey host |
| 4 mL glass vial | Wheaton | UX-08923-11 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma | S-8032 | |
| glass coverslip | Fisher Scientific | 12-544-G |
References
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
- Karperien, A., Ahammer, H., Jelinek, H. F. Quantitating the subtleties of microglial morphology with fractal analysis. Front Cell Neurosci. 7 (3), eCollection (2013).
- Taylor, S. E., Morganti-Kossmann, C., Lifshitz, J., Ziebell, J. M. Rod microglia: a morphological definition. PLoS One. 9 (5), e97096 (2014).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Abiega, O., et al. Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling. PLoS Biol. 14 (6), e1002466 (2016).
- Wyatt-Johnson, S. K., Herr, S. A., Brewster, A. L. Status Epilepticus Triggers Time-Dependent Alterations in Microglia Abundance and Morphological Phenotypes in the Hippocampus. Front Neurol. 8 (700), eCollection (2017).
- Morrison, H., Young, K., Qureshi, M., Rowe, R. K., Lifshitz, J. Quantitative microglia analyses reveal diverse morphologic responses in the rat cortex after diffuse brain injury. Sci Rep. 7 (1), 13211 (2017).
- Morrison, H. W., Filosa, J. A. A quantitative spatiotemporal analysis of microglia morphology during ischemic stroke and reperfusion. J Neuroinflammation. 10 (4), (2013).
- Gyoneva, S., Traynelis, S. F. Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors. J Biol Chem. 288 (21), 15291-15302 (2013).
- Xu, H., et al. Environmental Enrichment Potently Prevents Microglia-Mediated Neuroinflammation by Human Amyloid beta-Protein Oligomers. J Neurosci. 36 (35), 9041-9056 (2016).
- Rodriguez, J. J., Noristani, H. N., Verkhratsky, A. Microglial response to Alzheimer's disease is differentially modulated by voluntary wheel running and enriched environments. Brain Struct Funct. 220 (2), 941-953 (2015).
- Soltys, Z., et al. Quantitative morphological study of microglial cells in the ischemic rat brain using principal component analysis. J Neurosci Methods. 146 (1), 50-60 (2005).
- Orlowski, D., Soltys, Z., Janeczko, K. Morphological development of microglia in the postnatal rat brain. A quantitative study. Int J Dev Neurosci. 21 (8), 445-450 (2003).
- Morrison, H. W., Filosa, J. A. Sex differences in astrocyte and microglia responses immediately following middle cerebral artery occlusion in adult mice. Neuroscience. 339, (2016).
- Arganda-Carreras, I., Fernandez-Gonzalez, R., Munoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. 3D reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue. Microsc Res Tech. 73 (11), 1019-1029 (2010).
- Karperien, A. FracLac for ImageJ. , Available from: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/fraclac/FLHelp/Introduction.htm (2013).
- Davis, B. M., Salinas-Navarro, M., Cordeiro, M. F., Moons, L., De Groef, L. Characterizing microglia activation: a spatial statistics approach to maximize information extraction. Sci Rep. 7 (1), 1576 (2017).
- Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ (2014).
- Karperien, A. L., Jelinek, H. F., , Fractal, Multifractal, and Lacunarity Analysis of Microglia in Tissue Engineering. Front Bioeng Biotechnol. 3 (51), eCollection (2015).
- Martyanova, E. K., Tishkina, A. O. 3D quantitative analysis of microglial morphology. available as conference preceedings SkoltechOn. , (2015).
- Fernandez-Arjona, M. D. M., Grondona, J. M., Granados-Duran, P., Fernandez-Llebrez, P., Lopez-Avalos, M. D. Microglia Morphological Categorization in a Rat Model of Neuroinflammation by Hierarchical Cluster and Principal Components Analysis. Front Cell Neurosci. 11 (235), eCollection (2017).
