Intracraniële subarachnoïdale Route van infectie voor onderzoek naar rol van Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in een muismodel van de infectie
Summary
Hier beschrijven we de intracraniële subarachnoïdale route van infectie bij muizen te bestuderen van de rollen van biofilms in Streptococcus suis meningitis. Deze infectie model is ook geschikt voor de studie van de pathogenese van andere bacteriële meningitis en werkzaamheid van nieuwe medicijnen tegen bacteriële meningitis.
Abstract
Streptococcus suis is niet alleen een grote bacteriële ziekteverwekker van varkens wereldwijd, maar ook een opkomende zoönoseverwekker. Bij mensen en varkens is meningitis een grote manifestatie van S. suis infecties. Een model geschikt infectie is een essentieel instrument om het begrijpen van de mechanismen van ziekten veroorzaakt door pathogenen. Verschillende routes van infectie in muizen hebben ontwikkeld om te bestuderen van de pathogenese van S. suis -infectie. De routes van het intraperitoneaal intranasale en intraveneuze van infectie zijn echter niet geschikt voor de studie van de rollen van S. suis oppervlakte componenten in meningitis direct in de hersenen, zoals de extracellulaire matrix van biofilms. Hoewel intracisternal inoculatie is gebruikt voor S. suis -infectie, is de precieze injectieplaats niet beschreven. Hier, werd de intracraniële subarachnoïdale route van infectie beschreven in een muismodel te onderzoeken van de rol van biofilms in S. suis meningitis. S. suis planktonische cellen of biofilm staat cellen werden direct geïnjecteerd in de subarachnoïdale ruimte van muizen via de injectieplaats ligt 3,5 mm rostraal van de bregma. Histopathologisch analyse en verhoogde mRNA uitdrukking van TLR2 en cytokinen van het hersenweefsel van muizen ingespoten met cellen van biofilm staat duidelijk aangegeven dat S. suis biofilm definitieve rollen in S. suis meningitis speelt. Deze route van infectie heeft duidelijke voordelen ten opzichte van andere routes van infectie, waardoor de studie van de gastheer-bacterie interactie. Bovendien, het maakt het mogelijk het effect van bacteriële onderdelen op de immuunrespons van de gastheer direct in de hersenen worden beoordeeld, en bootst bacteriële ingang in het centrale zenuwstelsel. Deze route van infectie kan worden uitgebreid voor het onderzoeken van de mechanismen van meningitis veroorzaakt door andere bacteriën. Daarnaast kan het ook worden gebruikt voor het testen van de werkzaamheid van geneesmiddelen tegen bacteriële meningitis.
Introduction
Streptococcus suis (S. suis) is een grote bacteriële ziekteverwekker van varkens wereldwijd, waardoor ernstige ziekten, met inbegrip van hersenvliesontsteking, longontsteking, septikemie, endocarditis en artritis1. Het is ook een opkomende zoönoseverwekker. Tot nu toe, is het gemeld dat negen serotypen infectie bij de mens veroorzaken kunnen, met inbegrip van serotypen 2, 4, 5, 9, 14, 16, 21, 24 en 312,3,4. Bij mensen en varkens is meningitis een van de belangrijkste klinische symptomen van S. suis infecties. In Vietnam en Thailand is S. suis de voornaamste oorzaak van meningitis in volwassenen5. Microbiële biofilms zijn micro-organismen die zich aan elkaar en zijn geconcentreerd op een interface; ze zijn essentieel voor bacteriële virulentie, overleven in uiteenlopende omgevingen en antibioticaresistentie5. Biofilms zijn meestal omringd door een extracellulaire matrix waarin over het algemeen polysacchariden, eiwitten en DNA-6. De laatste kan uitlokken host inflammatoire reacties en cytokine productie7. Biofilm vorming is gemeld te worden betrokken bij de streptokokken meningitis in eerdere studies. Biofilms bijdragen tot Streptococcus agalactiae meningitis in een model van de vis tilapia en biofilm vorming binnen de hersenen weefsels is geopenbaard en rond meningeal oppervlakken in vivo via intra-abdominale inoculatie8. Tijdens de meningitis, Streptococcus pneumoniae is in een biofilm-achtige toestand en bacteriën in een dergelijke biofilm staat waren effectiever in het inducerende meningitis in een muis besmetting model9. Daarnaast, in onze vorige bestuderen, de biofilm staat gekoppeld aan S. suis in muis hersenen draagt bij aan bacteriële virulentie door survival analyse10. Direct bewijs voor biofilm betrokkenheid bij S. suis meningitis moet echter verder onderzocht worden.
Dierlijke modellen van S. suis -infectie hebben ontwikkeld in muizen met behulp van de intraperitoneaal (i.p.)11, intranasale (i.n.)12, intraveneuze (i.v.)13en de intracisternal (IC) routes van infectie14, 15 , 16. de i.p. i.n. en i.v. routes van infectie zijn echter niet geschikt voor de studie van de rollen van S. suis oppervlakte componenten in meningitis direct in de hersenen. Het gaat hierbij om extracellulaire matrix van biofilms. Hoewel de i.c. inoculatie werd gebruikt voor S. suis -infectie, is de precieze injectieplaats niet beschreven in deze documenten. De stereotaxic coördinaten van de injectieplaats voor intracraniële subarachnoïdale inoculatie is daarentegen duidelijk beschreven in een eerdere studie17. Dit toegestaan eenvoudige erkenning van de inoculatie punt en meer simplistische experimenteel protocol. Bovendien, bootst de intracraniële subarachnoïdale route van infectie bacteriële ingang in het centrale zenuwstelsel van de sinussen of het middenoor17, en de relatie tussen het middenoor en meningitis veroorzaakt door S. suis Madsen et al.18heeft aangetoond. Bovendien, door toepassing van de intracraniële subarachnoïdale route van infectie in muizen, hebben wij aangetoond dat S. suis kleine RNA rss04 tot meningitis in onze eerdere studie10 bijdraagt.
In de huidige studie, de intracraniële subarachnoïdale route van infectie werd gebruikt in muizen te onderzoeken van de rol van biofilms in S. suis meningitis. Muizen werden besmet met planktonische cellen of biofilm staat cellen van S. suis door deze route van infectie. Histopathologische analyses en verhoogde mRNA uitdrukking van TLR2 en cytokines van hersenweefsel van muizen ingespoten met cellen van biofilm staat duidelijk aangegeven dat S. suis biofilm tot meningitis bijdraagt.
Protocol
Representative Results
Discussion
De intracraniële subarachnoïdale route van infectie beschreven hier heeft duidelijke voordelen ten opzichte van andere routes van infectie. Het staat de onderzoekers bestuderen de gastheer-bacterie interactie en het effect van bacteriële onderdelen op host immuunrespons direct in de hersenen, die na te bootsen van bacteriële ingang in het centrale zenuwstelsel. Dus, deze route van infectie kan worden uitgebreid voor het onderzoeken van de mechanismen van meningitis veroorzaakt door andere bacteriën. Daarnaast kan he…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door subsidies van de nationale sleutel onderzoek en ontwikkeling programma van China [2017YFD0500102]; de Stichting nationale natuurwetenschappen van China [31572544]; de staat belangrijke laboratorium voor veterinaire etiologische biologie [SKLVEB2016KFKT005]; de Shanghai landbouw toegepast technologie ontwikkeling programma, China [G2016060201].
Materials
| Todd Hewitt Broth(THB) | Becton, Dickinson and Company | DF0492078 | Dissolve 30 g of the powder in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Agar | DSBIO | 16C0050 | Dissolve 15 g of the powder in 1 L of THB. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Milli-Q Reference Water Purification System | Merck KGaA | Z00QSVCUS | Without Dnase/ Rnase |
| NaCl | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Na2HPO3 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009012-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KCl | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009017-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KH2PO4 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009019-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KOH | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009014-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Glycerol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | Diluted with equal volumu of purified water, autoclave at 121° for 15 min |
| 4% paraformaldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 80096675 | |
| 25% Glutaraldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 30092436 | 10-fold diluted with purified water for fixation. |
| Ethanol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Chloroform | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10006818 | |
| Spctrophotometre | DeNovix Inc. | DS-11+ | |
| Ultrasound cell crusher | NingBo Scientz Biotechnology Co.,Ltd | JY96-IIN | |
| Centrifuge | Hitachi Koki Co., Ltd | CT15RE | |
| Refrigerator | Aucma Co., Ltd | DW-86L500 | |
| Scanning electron microscope | Zeiss | EVO-LS10 | |
| FastRNA Pro Green Kit | MP Biomedicals | #6045-050 | |
| FastPrep-24 Instrument | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Instrument for PCR | SensoQuest GmbH | 1124310110 | |
| QuantStudio 6 Flex | Thermo Fisher Scientific | 4485689 | |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR820A | |
| PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR047A | |
| Fully Enclosed Tissue Processor | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ASP200S | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica Biosystems Nussloch GmbH | EG1150H | |
| Semi-Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems Nussloch GmbH | RM2245 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems Nussloch GmbH | HI1210 | |
| Autostainer XL | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ST5010 | |
| Agilent 2100 | Agilent Technologies | G2939A | |
| Optical microscope | Olympus | BX51 |
References
- Gottschalk, M., Xu, J., Calzas, C., Segura, M. Streptococcus suis: a new emerging or an old neglected zoonotic pathogen?. Future Microbiology. 5, 371-391 (2010).
- Goyette-Desjardins, G., Auger, J. P., Xu, J., Segura, M., Gottschalk, M. Streptococcus suis, an important pig pathogen and emerging zoonotic agent-an update on the worldwide distribution based on serotyping and sequence typing. Emerging Microbes & Infections. 3 (6), e45 (2014).
- Kerdsin, A., et al. Emergence of Streptococcus suis serotype 9 infection in humans. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 50 (4), 545-546 (2017).
- Hatrongjit, R., et al. First human case report of sepsis due to infection with Streptococcus suis serotype 31 in Thailand. BMC Infect Diseases. 15, 392 (2015).
- Fittipaldi, N., Segura, M., Grenier, D., Gottschalk, M. Virulence factors involved in the pathogenesis of the infection caused by the swine pathogen and zoonotic agent Streptococcus suis. Future Microbiology. 7 (2), 259-279 (2012).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 95-108 (2004).
- Fuxman Bass, J. I., et al. Extracellular DNA: a major proinflammatory component of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Immunology. 184 (11), 6386-6395 (2010).
- Isiaku, A. I., et al. Biofilm is associated with chronic streptococcal meningoencephalitis in fish. Microbial Pathogenesis. 102, 59-68 (2017).
- Oggioni, M. R., et al. Switch from planktonic to sessile life: a major event in pneumococcal pathogenesis. Molecular Microbiology. 61 (5), 1196-1210 (2006).
- Xiao, G., et al. Streptococcus suis small RNA rss04 contributes to the induction of meningitis by regulating capsule synthesis and by inducing biofilm formation in a mouse infection model. Veterinary Microbiology. 199, 111-119 (2017).
- Dominguez-Punaro, M. C., et al. Streptococcus suis serotype 2, an important swine and human pathogen, induces strong systemic and cerebral inflammatory responses in a mouse model of infection. Journal of Immunology. 179 (3), 1842-1854 (2007).
- Seitz, M., et al. A novel intranasal mouse model for mucosal colonization by Streptococcus suis serotype 2. Journal of Medical Microbiology. 61 (Pt 9), 1311-1318 (2012).
- Busque, P., Higgins, R., Caya, F., Quessy, S. Immunization of pigs against Streptococcus suis serotype 2 infection using a live avirulent strain. Canadian Journal of Veterinary Research. 61 (4), 275-279 (1997).
- Williams, A. E., Blakemore, W. F. Pathology of Streptococcal meningitis following intravenous intracisternal and natural routes of infection. Neuropathology and Applied Neurobiology. 4 (4), 345-356 (1990).
- Dominguez-Punaro, M. C., et al. Severe cochlear inflammation and vestibular syndrome in an experimental model of Streptococcus suis infection in mice. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (9), 2391-2400 (2012).
- Auger, J. P., Fittipaldi, N., Benoit-Biancamano, M. O., Segura, M., Gottschalk, M. Virulence Studies of Different Sequence Types and Geographical Origins of Streptococcus suis Serotype 2 in a Mouse Model of Infection. Pathogens. 5 (3), (2016).
- Chiavolini, D., et al. Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice. BMC Microbiology. 4, 36 (2004).
- Madsen, L. W., Svensmark, B., Elvestad, K., Jensen, H. E. Otitis interna is a frequent sequela to Streptococcus suis meningitis in pigs. Veterinary Pathology. 38 (2), 190-195 (2001).
- Holden, M. T., et al. Rapid evolution of virulence and drug resistance in the emerging zoonotic pathogen Streptococcus suis. PLoS One. 4 (7), e6072 (2009).
- Dominguez-Punaro Mde, L., et al. In vitro characterization of the microglial inflammatory response to Streptococcus suis, an important emerging zoonotic agent of meningitis. Infection and Immunity. 78 (12), 5074-5085 (2010).
- Hassan, A., et al. Evaluation of different detection methods of biofilm formation in the clinical isolates. Brazilian Journal of Infectious Diseases. 15 (4), 305-311 (2011).
- Vanier, G., et al. New putative virulence factors of Streptococcus suis involved in invasion of porcine brain microvascular endothelial cells. Microbial Pathogenesis. 46 (1), 13-20 (2009).
- Takeuchi, D., et al. The contribution of suilysin to the pathogenesis of Streptococcus suis meningitis. Journal of Infectious Diseases. 209 (10), 1509-1519 (2014).
- Tenenbaum, T., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cellular Microbiology. 11 (2), 323-336 (2009).
