Intracraniana optou rota de infecção para investigar papéis de biofilmes de Streptococcus suis em meningite em um modelo de infecção do rato
Summary
Aqui, descrevemos a rota intracraniana optou de infecção em camundongos para estudar funções de biofilmes de Streptococcus suis meningite. Este modelo de infecção também é adequado para estudar a patogênese das outra meningite bacteriana e a eficácia de novas drogas contra meningite bacteriana.
Abstract
Streptococcus suis é não só um importante patógeno bacteriano de suínos no mundo, mas também um agente zoonótico emergente. Em humanos e suínos, a meningite é uma grande manifestação de S. suis infecções. Um modelo apropriado de infecção é uma ferramenta essencial para compreender os mecanismos das doenças causadas por agentes patogénicos. Várias rotas de infecção em camundongos foram desenvolvidas para estudar a patogênese da infecção por S. suis . No entanto, as rotas intraperitoneal, intranasais e intravenosa de infecção não são adequadas para estudar as funções dos componentes de superfície S. suis em meningite diretamente no cérebro, tais como a matriz extracelular de biofilmes. Embora intracisternal inoculação tem sido usada para infecção de S. suis , o site precisa de injeção não foi descrito. Aqui, na rota de infecção intracraniana optou foi descrita em um modelo do rato para investigar os papéis de biofilmes em S. suis meningite. S. suis planctônicos nas células ou biofilme estado foram diretamente injetado no espaço subaracnoide dos ratos através do site de injeção localizado 3,5 mm rostral do bregma. A análise histopatológica e aumento da expressão do mRNA de TLR2 e citocinas do tecido cerebral dos ratos injetados com células de biofilme estado claramente indicaram que o S. suis biofilme tem um papel definitivo na meningite S. suis . Esta rota de infecção tem óbvias vantagens sobre outras vias de infecção, permitindo o estudo da interação hospedeiro-bactéria. Além disso, ele permite que o efeito de componentes bacterianas no anfitrião respostas imunes diretamente no cérebro para ser avaliado e imita a entrada de bactérias no sistema nervoso central. Esta via de infecção pode ser estendida para investigar os mecanismos de meningite causada por outras bactérias. Além disso, ele também pode ser usado para testar a eficácia das drogas contra meningite bacteriana.
Introduction
Streptococcus suis (S. suis) é um importante patógeno bacteriano de suínos no mundo, causando doenças graves, incluindo meningite, pneumonia, septicemia, endocardite e artrite1. É também um agente zoonótico emergente. Até agora, tem sido relatado que nove sorotipos podem causar infecção nos seres humanos, incluindo os sorotipos 2, 4, 5, 9, 14, 16, 21, 24 e 31,2,3,4. Em humanos e suínos, a meningite é um dos principais sinais clínicos de S. suis infecções. No Vietnã e Tailândia, o S. suis é a principal causa de meningite em adultos5. Biofilmes microbianos são microorganismos que aderem-se uns aos outros e se concentram em uma interface; Eles são essenciais para a virulência bacteriana, sobrevivência em diversos ambientes e a resistência aos antibióticos5. Biofilmes são tipicamente rodeados por uma matriz extracelular que geralmente contém polissacarídeos, proteínas e DNA6. O último é capaz de eliciar respostas inflamatórias do hospedeiro e a produção de citocinas7. Formação de biofilme foi relatada para ser envolvido em meningite estreptocócica em estudos anteriores. Biofilmes contribuam para meningite Streptococcus agalactiae em um modelo de peixe tilápia e formação de biofilmes foi revelada dentro de tecidos do cérebro e ao redor meníngea superfícies na vivo através de de inoculação intra-abdominal8. Durante a meningite, Streptococcus pneumoniae está em um estado de biofilme e bactérias em um biofilme estado foram mais eficazes na indução de meningite em um rato infecção modelo9. Além disso, no nosso anterior estudo, o estado de biofilme associado S. suis em cérebro de rato contribui para a virulência bacteriana por sobrevivência análise10. No entanto, a evidência direta para envolvimento de biofilme em S. suis meningite requer mais investigação.
Foram desenvolvidos modelos animais de infecção de S. suis em ratos usando o intraperitoneal (i.p.)11, intranasal (óssea)12, intravenosa (i.v.)13e as intracisternal (i.c.) rotas de infecção14, 15 , 16. no entanto, os i.p., óssea e i.v. rotas de infecção não são adequadas para estudar as funções dos componentes de superfície S. suis em meningite diretamente no cérebro. Estes incluem matriz extracelular de biofilmes. Mas a inoculação de i.c. foi usada para infecção de S. suis , o site precisa de injeção não foi descrito os jornais. Em contraste, as coordenadas estereotáxicos do local da injeção para inoculação intracraniana optou claramente tem sido descrita em um anterior estudo17. Isto permitiu o fácil reconhecimento do ponto de inoculação e mais simplista protocolo experimental. Além disso, na rota de infecção intracraniana optou imita a entrada de bactérias no sistema nervoso central dos seios do face ou do ouvido médio,17e a relação entre o ouvido médio e a meningite causada por S. suis tem sido demonstrado por Madsen et al.18. Além disso, aplicando-se a rota intracraniana optou de infecção em camundongos, demonstrámos que o S. suis pequeno RNA rss04 contribui para meningite em nosso anterior de estudo10.
No presente estudo, na rota de infecção intracraniana optou foi usada em ratos para investigar os papéis de biofilmes em meningite S. suis . Camundongos foram infectados com células planctônicas ou biofilme estado de S. suis por esta via de infecção. A análise histopatológica e aumento da expressão do mRNA de TLR2 e citocinas do tecido de cérebro de ratos injetados com células de biofilme estado claramente indicaram que o S. suis biofilme contribui para a meningite.
Protocol
Representative Results
Discussion
A rota intracraniana optou de infecção descrita aqui tem óbvias vantagens sobre outras vias de infecção. Ele permite que os investigadores a estudar a interação hospedeiro-bactéria e o efeito de componentes bacterianas em respostas imunes host diretamente no cérebro, que imitam a entrada de bactérias no sistema nervoso central. Assim, esta via de infecção pode ser estendida para investigar os mecanismos de meningite causada por outras bactérias. Além disso, ele também pode ser usado para testar a eficácia…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por subsídios da pesquisa nacional de chave e programa de desenvolvimento da China [2017YFD0500102]; a Fundação Nacional de ciências naturais da China [31572544]; o laboratório estadual chave de veterinária etiológico biologia [SKLVEB2016KFKT005]; a agricultura de Shanghai aplicada tecnologia desenvolvimento programa, China [G2016060201].
Materials
| Todd Hewitt Broth(THB) | Becton, Dickinson and Company | DF0492078 | Dissolve 30 g of the powder in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Agar | DSBIO | 16C0050 | Dissolve 15 g of the powder in 1 L of THB. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Milli-Q Reference Water Purification System | Merck KGaA | Z00QSVCUS | Without Dnase/ Rnase |
| NaCl | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Na2HPO3 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009012-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KCl | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009017-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KH2PO4 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009019-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KOH | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009014-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Glycerol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | Diluted with equal volumu of purified water, autoclave at 121° for 15 min |
| 4% paraformaldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 80096675 | |
| 25% Glutaraldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 30092436 | 10-fold diluted with purified water for fixation. |
| Ethanol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Chloroform | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10006818 | |
| Spctrophotometre | DeNovix Inc. | DS-11+ | |
| Ultrasound cell crusher | NingBo Scientz Biotechnology Co.,Ltd | JY96-IIN | |
| Centrifuge | Hitachi Koki Co., Ltd | CT15RE | |
| Refrigerator | Aucma Co., Ltd | DW-86L500 | |
| Scanning electron microscope | Zeiss | EVO-LS10 | |
| FastRNA Pro Green Kit | MP Biomedicals | #6045-050 | |
| FastPrep-24 Instrument | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Instrument for PCR | SensoQuest GmbH | 1124310110 | |
| QuantStudio 6 Flex | Thermo Fisher Scientific | 4485689 | |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR820A | |
| PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR047A | |
| Fully Enclosed Tissue Processor | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ASP200S | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica Biosystems Nussloch GmbH | EG1150H | |
| Semi-Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems Nussloch GmbH | RM2245 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems Nussloch GmbH | HI1210 | |
| Autostainer XL | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ST5010 | |
| Agilent 2100 | Agilent Technologies | G2939A | |
| Optical microscope | Olympus | BX51 |
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