यहां हम GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, मीर-1, और मीर-१३३ (GHMT2m) TGF के अवरोध के साथ-β संकेतन के माध्यम से कार्यात्मक cardiomyocytes में प्राथमिक भ्रूण fibroblasts reprogram करने के लिए एक मजबूत विधि वर्तमान । हमारे प्रोटोकॉल के रूप में 7 दिनों के बाद ६०% दक्षता के साथ transduction के रूप में जल्दी cardiomyocytes धड़कन उत्पंन करता है ।
ट्रांस एक दूसरे में शारीरिक कोशिका प्रकार के भेदभाव मॉडल और मानव रोगों के इलाज के लिए भारी क्षमता है । पिछले अध्ययनों से पता चला है कि माउस भ्रूण, चमड़े का, और कार्डियक fibroblasts कार्यात्मक प्रेरित-cardiomyocyte की तरह कोशिकाओं (iCMs) फुलाव प्रतिलेखन कारकों में से GATA4, Hand2, Mef2c सहित के माध्यम से पुनर्निर्मित किया जा सकता है, और Tbx5 दोनों इन विट्रो में और vivo में। हालांकि, इन पिछले अध्ययनों अपेक्षाकृत कम दक्षता दिखाया गया है । आदेश में चोट के बाद दिल समारोह को बहाल करने के लिए, हृदय reprogramming शासी तंत्र दक्षता और iCMs की परिपक्वता को बढ़ाने के लिए आविर्भाव किया जाना चाहिए ।
हम पहले से प्रदर्शन किया है कि प्रो के निषेध-fibrotic नाटकीय रूप से reprogramming दक्षता बढ़ संकेतन । यहां, हम विस्तार तरीकों को ६०% तक की एक reprogramming दक्षता प्राप्त करने के लिए । इसके अलावा, हम प्रवाह cytometry, immunofluorescent इमेजिंग, और कैल्शियम इमेजिंग सहित कई तरीकों का वर्णन reprogramming दक्षता और fibroblasts की परिपक्वता को बढ़ाता है । यहां विस्तृत प्रोटोकॉल का प्रयोग, यंत्रवत अध्ययन के लिए हृदय reprogramming के सकारात्मक और नकारात्मक नियामकों निर्धारित किया जा सकता है । इन अध्ययनों से संकेतन रास्ते कि reprogramming दक्षता और परिपक्वता, जो उपंयास कोशिका उपचार के लिए मानव हृदय रोग के इलाज के लिए ले जा सकता को बढ़ावा देने के लिए लक्षित किया जा सकता है की पहचान कर सकते हैं ।
कोरोनरी हृदय रोग संयुक्त राज्य अमेरिका में मौत का एक प्रमुख कारण है1. लगभग ८००,००० अमेरिकियों एक पहले या आवर्तक रोधगलन (MI) प्रति वर्ष1अनुभव । एमआई के बाद, cardiomyocytes (सीएमएस) और हृदय फाइब्रोसिस, सक्रिय कार्डियक fibroblasts द्वारा जमा की मौत, दिल समारोह2,3ख़राब । दिल की विफलता के बाद आई एम सी की प्रगति मोटे तौर पर वयस्क सीएमएस4,5के गरीब पुनर्उत्पादक क्षमता के कारण अपरिवर्तनीय है । जबकि वर्तमान नैदानिक चिकित्सा धीमी रोग प्रगति और भविष्य के हृदय की घटनाओं की कमी जोखिम6,7,8,9, कोई उपचार रिवर्स रोग प्रगति करने के लिए असमर्थता के कारण 10सेमी पोस्ट-रोधगलन पुनर्जीवित । उपंयास सेल चिकित्सा एमआई के बाद रोगियों का इलाज करने के लिए उभर रहे हैं । निराशाजनक, नैदानिक परीक्षण दिल के लिए स्टेम सेल वितरित इस प्रकार अब तक अनिर्णायक पुनर्जन्म संभावित11,12दिखाया गया है, 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.
मानव की पीढ़ी से प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) fibroblasts से चार प्रतिलेखन कारकों के व्यक्त द्वारा, पहले ताकाहाशी और यामानाका द्वारा प्रदर्शन किया, सेल थेरेपी में नई सफलताओं के लिए दरवाजा खोला19। इन कोशिकाओं को सभी तीन रोगाणु परतें19में अंतर कर सकते हैं, और सीएमएस की बड़ी संख्या में पैदा करने के लिए कई अत्यधिक कुशल तरीके पहले20,21दिखाया गया है । HiPSC-व्युत्पन्न सीएमएस (कूल्हों-सीएमएस) cardiomyogenesis अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मंच प्रदान करता है और चोट के बाद दिल की मरंमत के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ हो सकता है । हालांकि, कूल्हों-सीएमएस वर्तमान में teratoma गठन22की चिंताओं के कारण अनुवाद बाधाओं का सामना करना पड़ता है, और उनके अपरिपक्व प्रकृति समर्थक arrhythmogenic23हो सकता है । hiPSCs में reprogramming fibroblasts सीधे reprogramming अंय प्रकार के कक्ष में fibroblasts में रुचि छिड़ । Ieda एट अल. का प्रदर्शन किया है कि GATA4, Mef2c, और Tbx5 (जीएमटी) के fibroblasts परिणामों में हृदय वंश को सीधे reprogramming में, हालांकि कम दक्षता24पर व्यक्त । reprogramming दक्षता Hand2 के अलावा के साथ सुधार किया गया था (GHMT)25। इन प्रारंभिक अध्ययन के बाद से, कई प्रकाशनों का प्रदर्शन किया है कि अतिरिक्त प्रतिलेखन कारकों के साथ reprogramming फैक्टर कॉकटेल में फेरबदल26,27,28,29, क्रोमेटिन संशोधक30,31, microRNAs३२,३३, या छोटे अणुओं३४ को बेहतर reprogramming दक्षता और/या प्रेरित cardiomyocyte की तरह कोशिकाओं की परिपक्वता की ओर जाता है (iCMs ).
यहाँ हम उच्च दक्षता के साथ माउस भ्रूण fibroblasts (MEFs) से iCMs उत्पन्न करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । हम पहले से पता चला है कि GHMT कॉकटेल मीर के अलावा के साथ काफी सुधार हुआ है-1 और मीर-१३३ (GHMT2m) और आगे सुधार हुआ है जब प्रो-fibrotic संकेतन वृद्धि कारक β (TGF-β) संकेतन या Rho-जुड़े सहित रास्ते प्रोटीन कळेनासे (रॉक) संकेत रास्ते३५हिचक रहे हैं । इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, हम बताते है कि लगभग ६०% कोशिकाओं के हृदय ट्रोपोनिन टी (cTnT) एक्सप्रेस, लगभग ५०% एक्सप्रेस α-actinin, और धड़कन कोशिकाओं की एक उच्च संख्या के रूप में जल्दी मनाया जा सकता है 11 दिन के रूप में reprogramming कारकों और उपचार के transduction निंनलिखित TGF-β प्रकार I रिसेप्टर अवरोधक एक-83-01 के साथ. इसके अलावा, इन iCMs एक्सप्रेस connexin ४३ और प्रदर्शन सहज संकुचन और कैल्शियम यात्रियों सहित अंतर जंक्शन प्रोटीन । यह पहले के अध्ययनों की तुलना में दक्षता reprogramming में सुधार के रूप में चिह्नित अंतर्जात कोशिका आबादी है कि दिल के बाद रोधगलन में रहने से सीएमएस पुनर्जंम की क्षमता को दर्शाता है ।
वर्तमान अध्ययन GHMT2m reprogramming कारकों के दमन के साथ संयुक्त प्रो fibrotic संकेत रास्ते के वितरण के माध्यम से कार्यात्मक iCMs में fibroblasts सीधे reprogram करने के लिए एक उच्च दक्षता रणनीति की रूपरेखा । प्रवाह cytometry, immunofluorescent इमेजिंग, क…
The authors have nothing to disclose.
इस अनुसंधान Boettcher है फाउंडेशन वेब से धन द्वारा समर्थित था-Waring बायोमेडिकल रिसर्च प्रोग्राम, अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन वैज्ञानिक विकास अनुदान (13SDG17400031), चिकित्सा बकाया जल्दी कैरियर के कोलोराडो विश्वविद्यालय विभाग विद्वान कार्यक्रम, कार्डियोलोजी बारलो Nyle बंदोबस्ती के कोलोराडो डिवीजन के विश्वविद्यालय, और NIH R01HL133230 (के लिए के. एस.) । ए. एस. आर NIH/NCATS कोलोराडो CTSA अनुदान संख्या TL1TR001081 और एक पूर्व डॉक्टरेट फैलोशिप यूनिवर्सिटी ऑफ कोलोराडो कंसोर्टियम फॉर फाइब्रोसिस रिसर्च एंड ट्रांसलेशन (CFReT) द्वारा समर्थित किया गया था । यह शोध भी कैंसर केंद्र सहायता अनुदान (P30CA046934), त्वचा रोग अनुसंधान कोर अनुदान (P30AR057212), और कोलोराडो Anschutz चिकित्सा परिसर में विश्वविद्यालय में प्रवाह Cytometry कोर द्वारा समर्थित किया गया था ।
C57BL/6 Mice | Charles River's Laboratory | 027 | For MEF isolation |
Platinum E (PE) Cells | Cell Biolabs, INC | RV-101 | For retrovirus production |
DMEM High Glucose | Gibco | SH30022.FS | Component of iCM, PE, and Growth media |
Medium 199 | Life Technologies | 11150-059 | Component of iCM media |
Fetal Bovine Serum | Gemini | 100106 | Component of iCM, PE, and Growth media |
Donor Horse Serum | Gemini | 100508 500 | Component of iCM media |
MEM Essential Amino Acids, 50X | Life Technologies | 11130051 | Component of iCM media |
Sodium Pyruvate Solution, 100X | Life Technologies | 11360070 | Component of iCM media and for calcium imaging |
MEM Non-Essential Amino Acids, 100X | Life Technologies | 11140050 | Component of iCM media |
MEM Vitamin Solution, 100X | Life Technologies | 11120-052 | Component of iCM media |
Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 41400045 | Component of iCM media |
B27 | Gibco | 17504-044 | Component of iCM media |
Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of iCM, PE, and Growth media |
GlutaMAX (L-Glutamine Supplement) | Gibco | 35050-061 | Component of iCM, PE, and Growth media |
Blasticidin-HCl | Life Technologies | A11139-03 | Component of PE media |
Puromycin dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | Component of PE media |
0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | For detaching cells from culture dishes |
A-83-01 | R&D Systems – Tocris | 2939/10 | Treat cells to inhibit TGF-β signaling – promotes high efficiecy reprogramming. Use at 0.5 µM |
DMSO | Thermo Scientific | 85190 | For dilution and storage of A-83-01 and component of Freeze Medium |
SureCoat | Cellutron | SC-9035 | For coating dishes to plate MEFs |
FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection Reagent |
Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 11058-021 | Transfection Reagent |
pBabe-X Myc-GATA4 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
pBabe-X Myc-Hand2 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
pBabe-X Myc-Mef2c | Plasmid containing reprogramming factor | ||
pBabe-X Myc-Tbx5 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
pBabe-X miR-1 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
pBabe-X miR-133 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
pBabe-X GFP | Plasmid containing reprogramming factor | ||
Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma | H9268-5G | For viral induction. Use at a concentration of 6 µg/mL |
Vacuum Filter + bottles (0.22 µm pores) | Nalgene | 569-0020 | For filtering media |
Syringes | Bd Vacutainer Labware | 309654 | For viral filtration |
0.45 µm Filters | Celltreat | 229749 | For viral filtration |
70 µm cell strainers | Falcon | 352350 | For MEF isolation and Flow Cytometry |
Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | For fixation and permeabilization of cells for flow cytometry |
perm/wash buffer | BD | 554723 | For washing cells for flow cytometry |
DPBS 1X | Gibco | 14190-250 | For washing cells |
Bovine Serum Albumin | VWR | 0332-100g | For flow cytometry and calcium imaging |
Goat Serum | Sigma | G9023 | For blocking cells for Flow Cytometry |
Donkey Serum | Sigma | D9663-10mg | For blocking cells for Flow Cytometry |
Mouse Troponin T | Thermo Scientific | ms-295-p | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
Mouse α-actinin | Sigma | A7811L | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
Rabbit Connexin 43 | Sigma | C6219 | 1:400 IF |
Rabbit Troponin I | PhosphoSolutions | 2010-TNI | 1:400 IF |
Hoechst | Life Technologies | 62249 | 1:10000 IF |
Alexa 488, rabbit | Life Technologies | A-11034 | 1:800 IF |
Alexa 555, mouse | Life Technologies | A-21422 | 1:800 IF |
Alexa 647, mouse | Life Technologies | A-31571 | 1:200 Flow Cytometry |
27-color ZE5 Flow Cytometer | Bio-RAD | For FACS | |
Paraformaldehyde | sigma | P6148-500mg | For fixing cells for IF |
Triton X-100 | Promega | H5142 | For permeabilization of cells for IF |
EVOS™ FL Color Imaging System | Thermo Scientific | AMEFC4300 | For IF |
NaCl | RPI | S23020-5000 | For calcium imaging |
KCl | VWR | 395 | For calcium imaging |
CaCl2 | Fisher | C614-500 | For calcium imaging |
MgCl2 | VWR | 97061-352 | For calcium imaging |
glucose | sigma | G7528-250g | For calcium imaging |
HEPES | sigma | H4034-500g | For calcium imaging |
Fura-2 AM | Life Technologies | F1221 | For calcium imaging |
Fluronic F-127 | Sigma | P2443-250g | For calcium imaging |
Nifedipine | Sigma | N7634-1G | For disruption calcium transients in iCMs – use at 10 µM |
Isoproterenol | sigma | I6504-1g | For increasing number of calcium transients in iCMs – use at 1-2 µM |
Marianas Spinning Disk Confocal microscope | 3i | For calcium imaging | |
ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
bleach | Clorox | ||
50 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 227261 | |
15 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 188271 | |
15 cm cell culture dishes | Falcon | 353025 | |
10 cm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
60 mm cell culture dishes | GREINER BIO-ONE | 628160 | |
6 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
12 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 665180 | |
24 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 662160 |