Multi-Color-Lokalisierung Mikroskopie des einzigen Membranproteine in Organellen der lebenden Säugetier-Zellen
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die multi-Color Lokalisierung der einzelnen Membranproteine in Organellen der lebenden Zellen. Um Fluorophore zu befestigen, sind selbst Kennzeichnung Proteine verwendet. Proteine, befindet sich in verschiedenen Membranen Kompartimenten des die gleichen Organellen lokalisiert werden können, mit einer Genauigkeit von ~ 18 nm.
Abstract
Wissen über die Lokalisierung von Proteinen in zellulären Subcompartments ist entscheidend für ihre spezifische Funktion zu verstehen. Hier präsentieren wir Ihnen eine super-Resolution-Technik, die für die Bestimmung der Microcompartments, die zugänglich für Proteine sind ermöglicht durch Erzeugung von Lokalisierung und tracking-Karten dieser Proteine. Darüber hinaus werden durch multi-Color-Lokalisierung-Mikroskopie, die Lokalisierung und Überwachungsprofile von Proteinen in unterschiedlichen Subcompartments gleichzeitig erhalten. Die Technik ist speziell für lebende Zellen und basiert auf die sich wiederholenden Darstellung der einzigen mobilen Membranproteine. Interessierenden Proteine sind genetisch mit bestimmten, sogenannten Self Labelling Tags fusioniert. Diese Tags sind Enzyme, die mit einem Substrat kovalent zu reagieren. Auf diese Substrate konjugiert sind fluoreszierende Farbstoffe. Reaktion der Enzym-markierten Proteine mit der Fluoreszenz beschriftet Substrate Ergebnisse in markierte Proteine. Hier werden Tetramethylrhodamine (TMR) und Silizium Rhodamine (SiR) als Fluoreszenz-Farbstoffen beigefügt, die Substrate der Enzyme eingesetzt. Substrat-Konzentrationen in der pM, nM-Bereich verwenden, wird Sub stöchiometrischen Kennzeichnung erreicht, der deutliche Signale führt. Diese Signale werden lokalisiert, mit ~ 15 – 27 nm Präzision. Die Technik ermöglicht multi-Color Imaging von einzelne Moleküle, wobei die Anzahl der Farben durch die verfügbaren Membran durchlässig Farbstoffe und das Repertoire der selbstbeschriftung Enzyme begrenzt wird. Wir zeigen die Machbarkeit der Technik durch die Bestimmung der Lokalisation des Enzyms Qualitätskontrolle (Pten)-induzierte Kinase 1 (PINK1) in verschiedenen mitochondrialen Kompartimenten während seiner Verarbeitung in Bezug auf andere Membranproteine. Der Test für echte physikalische Wechselwirkungen zwischen unterschiedlich markierte einzelne Proteine durch Einzelmolekül Bund oder Co-Tracking ist jedoch beschränkt, weil die niedrigen Kennzeichnung Grad die Wahrscheinlichkeit verringern dafür, dass zwei benachbarte Proteine gleichzeitig beschriftet. Während die Technik für imaging-Proteine in Membran Fächer stark ist, ist in den meisten Fällen es nicht angebracht, die Lokalisierung der hochmobilen lösliche Proteine bestimmen.
Introduction
Das Ziel dieses Protokolls ist, bieten ein bildgebendes Verfahren zu lokalisieren und einzelne Membranproteine in lebenden Zellen zu verfolgen. Wir nennen diese Methode Tracking und Localization Microscopy (Talmor)1,2. Talmor ist wie stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie (Sturm)3 und Photoaktivierungen Lokalisierung Fluoreszenzmikroskopie ((F) PALM)4,5ein einzelnes Molekül-basierte Fluoreszenz Lokalisierung Technik. Es unterscheidet sich jedoch in der Weise, dass die Mobilität von Membranproteinen in Kombination mit sich wiederholenden Darstellung desselben Moleküls an verschiedenen Positionen zeigt die Microcompartment beschriftet, die zugänglich für das mobile Protein ist. Das heißt, werden die möglichen Lokalisierungen des Proteins von der Architektur der Organellen und durch die Mobilität der Protein-1festgelegt. Die Methode ist komplementär zu verschiedenen anderen Höchstauflösung Techniken6,7,8 , weil es zeigt, Lokalisierung und die Flugbahn Karten durch bildgebende mobile Proteine. Die Kennzeichnung basiert auf der Verwendung gentechnisch veränderter Fusionsproteine, die per se nicht fluoreszierenden sind. Diese Schmelzverfahren Proteine sind Enzyme selbstbeschriftung, die kovalent mit einem Substrat zu einem Farbstoff konjugiert zu reagieren. Dieses Verfahren hat den Vorteil, dass die Kennzeichnung Grad kann durch die Menge an zusätzlichen Substrat gesteuert. Darüber hinaus ermöglicht es die Farbe der Fluoreszenz, abhängig von der gewählten konjugierten Farbstoff variieren. Einige selbst Kennzeichnung Enzym-Tags sind verfügbar9. Ein weiterer Vorteil der Verwendung selbstbeschriftung Enzym-Tags ist, dass die konjugierte Farbstoffe sind in der Regel stabiler und heller als fluoreszierende Proteine1 und einzelne Proteine daher mehr aufgezeichnet werden können und vieles mehr, eben bis sie gebleicht werden. Dies ermöglicht die Aufnahme von Trajektorien von mobilen Proteinen und der Gewinnung von Diffusion Koeffizienten10,11.
Hier zeigen wir die Machbarkeit der Talmor mit mitochondrialen Membranproteine, aber es kann auch für andere Intra und extra zellulare Membranproteine, einschließlich andere Zelle Arten12,13angewendet werden. Wir zeigen, dass multi-Color Talmor weiter die gleichzeitige Unterscheidung von Proteinen in verschiedenen Subcompartments in Ergänzung zur bestehenden Höchstauflösung Fluoreszenz-Mikroskopie-Techniken14,15, ermöglicht 16. Talmor ist kompatibel mit live Cell imaging-17. Die Foto-Physik von der gewählten Rhodamine Tetramethylrhodamine (TMR) und Silikon-Rhodamien (SiR), insbesondere ihre Helligkeit und Stabilität, ermöglicht Rekord einzelne Membranproteine über mehrere Frames mit Lokalisierung (und die Flugbahn) Karten. Talmor ist jedoch für die Lokalisierung von löslichen Proteinen mit hohen Diffusionskoeffizienten beschränkt, da die Bewegungsunschärfe zu hoch ist und die gesammelten Photonen pro Frame zu niedrig für die korrekte Lokalisierung sind. Außerdem erfordert Talmor weniger erregerleistung als z.B. Sturm oder stimulierte Emission Depletion (STED) Mikroskopie6,7, phototoxische Effekte reduzieren. Dies ist wichtig, da phototoxische Stress oft Organellen Morphologie18 und damit Mobilität Analyse19beeinflusst. Zusammenfassend lässt sich sagen, wir präsentieren mehrfarbige Talmor in lebenden Zellen als eine Technik, die eine Lücke zwischen der Lokalisierung Mikroskopieverfahren Sturm/STED füllt / (F) PALM und Techniken, die Protein Mobilität wie Fluoreszenz Erholung nach Immunofluoreszenz analysieren (FRAP)20 ,21, Fluoreszenz Korrelation Spektroskopie (FCS)22und Fluoreszenz überqueren Korrelation Spektroskopie (FCC)11,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wurde eine Technik für dual Farbe Einzelmolekül Lokalisierung von mobilen Membranproteine vorgestellt. Nach dem Protokoll Membranproteine sind verschmolzen, zur selbstbeschriftung Proteine, die mit Rhodamin Farbstoffe TMR und SiR konjugiert zu ihrer jeweiligen Substrate reagieren. Rhodamin Farbstoffe sind hell und Photostabil und damit für sich wiederholende bildgebenden1. Für eine erfolgreiche Leistung müssen mehrere Bedingungen und kritische Themen im Auge behalten werden.
<p class…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten die Biophysik Gruppe und Jacob Piehler an der Universität Osnabrück für kontinuierliche Unterstützung, Wladislaw Kohl für technische Hilfe und Vorbereitung des Materials und der CellNanOs-Vorstand für die Bereitstellung von Mikroskopen für den Einsatz danken. Das Projekt wurde von der SFB 944 finanziert.
Materials
| (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M) (HEPES) | Biochrom | #1104E | |
| DC1: Dichroid beam splitter | Chroma | 640 dcxr | NC506031 |
| DC2: Polychroic Mirror, beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/640rpc | discontinued |
| Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x (w/o Ca & Mg) | Sigma-Aldrich & Co. | #RNBF8311 | |
| Earle´s MEM without phenol red, without L-Glutamine and without NaHCO3 containing 1% FBS, 0.1% HEPES, 0.1% NEAA, 0.1% Alanyl-L-Glutamine and 34.78% sodium hydrogen carbonate (NaHCO3 0.75g/l) | Imaging medium | ||
| Earle´s minimum essential medium (MEM) with phenol red, containing 1% Fetal Bovine Serum Superior (FBS), 0.1% HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M), and 0.1% non-essential amino acids (NEAA) | Growth medium | ||
| EF: Emission filter quadbandpass | AHF analysentechnik | F72-866 | Brightline HC 446 nm/523 nm/600 nm/677 nm |
| EMCCD camera | Andor | Andor iXON 897 | EMCCD camera |
| Emission filter QuadView filter cubes, orange | AHF analysentechnik | F39-637 | bandpass 582 – 619 nm |
| Emission filter QuadView filter cubes, red | Chroma | bandpass 655 – 725 nm (HQ 690/70) | |
| FBS (Fetal bovine serum) superior | Biochrom | S0615 | |
| Fluorescent beads: TetraSpeck™ Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red | Thermo Fisher Scientific | T7279 | fluorescent microspheres |
| Glutamine | Biochrom | #0951C | |
| HeLa cells | DSMZ | ACC-57 | Cervical carcinoma cells from patient Henrietta Lacks |
| Hela cells CI::paGFP, stable | Muster et al., PLOSOne 2010 | ||
| Hela cells CV g::Halo7-Tag, stable | Appelhans et al., NanoLett 2012 | ||
| Hela cells Tom20::Halo7-Tag, stable | Appelhans et al., NanoLett 2012 | ||
| Image splitter | Photometrics | Dual-View QV2 | image splitter emission |
| Imaging processing software | ImageJ2 / Fiji | freeware | |
| Immersion Oil – ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45) | Carl Zeiss Jena GmbH | 444960-0000-000 | |
| Inverted epifluorescence microscope | Olympus IX-71/73/83 | ||
| Laser 561 nm, 200 mW | CrystaLaser | CL-561-200 | 561 nm emission |
| Laser 642 nm, 140 mW | Omicron | Luxx-642-140 | 642 nm emission |
| MATLAB | MathWorks | version R2013a | |
| MEM with Earle's Balanced Salt Solution 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine w/o PR | Biochrom | FG-0385 | |
| MEM with Earle's Balanced Salt Solution with 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine, Phenolred | Biochrom | FG-0325 | |
| MitoTracker® Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | dye |
| MitoTracker® Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | dye |
| Multi-mode-optical polarization maintaining monomode fiber | Pointsource/Qioptiq | KineFLEX | |
| NHS-PEG-MAL, Rapp Polymer | Rapp Polymere GmbH Tübingen | coverslip coating | |
| non-essential amino acids (NEAA) | Biochrom | #0802E | |
| PEG 800 (Polyethylene glycol) 10 % | Carl Roth GmbH | Art No. 0263.1 | coverslip coating |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | #0122E | |
| Plasmid for PINK1-Halo7-Tag expression | Beinlich et al., ACS Chemical Biology 2015 | ||
| Poly-L-lysine (1.2 mg/ml) | Sigma-Aldrich & Co. | Cat. No.P9155 | coverslip coating |
| RGD Peptide (Ac-CGRGDS-COOH) | Coring System Diagnostix GmbH, Gernsheim | coverslip coating / Intergrin receptor motif | |
| Silicon Rhodamine linked to HaloTag®-Ligand (SiRHTL) | personal gift from Kai Johnson | dye | |
| Software analysis plugin | self-written C. P. Richter, Biophysik Osnabrück | SLIMFAST 16g | |
| Tetramethylrhodamine / SNAP-Cell® TMR-Star linked to SNAP-Ligand (TMRstar) | New England Biolab® | S9105S | dye |
| Tetramethylrhodamine linked to HaloTag®-Ligand (TMRHTL) | Promega | G8251 | dye |
| TIRF condensor | Olympus | Cell^TIRF MITICO System | TIRF condensor |
| TIRF microscope controlling software | Olympus cellSens 1.12 | ||
| TIRF objective | Olympus | 150x oil objective (N.A. 1.45; Olympus UAPO) | |
| Trypsin/EDTA 10x | Biochrom | #0266 | |
| Water H2O 99,5 % Rotipuran® Low organic | Carl Roth GmbH | Art. No. HN57.1 |
References
- Appelhans, T., Richter, C., Wilkens, V., Hess, S., Piehler, J., Busch, K. Nanoscale organization of mitochondrial microcompartments revealed by combining tracking and localization microscopy. Nano Letters. 12 (2), 610-616 (2012).
- Appelhans, T., Busch, K. Single Molecule Tracking and Localization of Mitochondrial Protein Complexes in Live Cells. Methods Mol Biol. 1567, 273-291 (2017).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Gould, T. J., Verkhusha, V. V., Hess, S. T. Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy. Nat Protoc. 4 (3), 291-308 (2009).
- Pennacchietti, F., Gould, T. J., Hess, S. T. The Role of Probe Photophysics in Localization-Based Superresolution Microscopy. Biophys J. 113 (9), 2037-2054 (2017).
- Wegel, E., Göhler, A., Lagerholm, B. C., Wainman, A. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific reports. , (2016).
- Pellett, P., et al. Two-color STED microscopy in living cells. Biomedical Optics Express. 2 (8), (2011).
- Ishigaki, M., et al. STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells. Mitochondrion. 28, 79 (2016).
- Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy. Scientific Reports. 5, 17740 (2015).
- Sergé, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nat Methods. 5 (8), (2008).
- Appelhans, T., Busch, K. B. Dynamic imaging of mitochondrial membrane proteins in specific sub-organelle membrane locations. Biophysical reviews. 9 (4), 345-352 (2017).
- Wilmes, S., et al. Triple-color super-resolution imaging of live cells: resolving submicroscopic receptor organization in the plasma membrane. Angewandte Chemie. 51 (20), 4868-4871 (2012).
- Niewidok, B., et al. Single-molecule imaging reveals dynamic biphasic partition of RNA-binding proteins in stress granules. J Cell Biol. , (2018).
- Wurm, C. A., Jakobs, S. Differential protein distributions define two sub-compartments of the mitochondrial inner membrane in yeast. FEBS Lett. 580 (24), 5628-5634 (2006).
- Schmidt, R., Wurm, C. A., Punge, A., Egner, A., Jakobs, S., Hell, S. W. Mitochondrial cristae revealed with focused light. Nano Lett. 9 (6), 2508-2510 (2009).
- Kukat, C., Wurm, C. A., Spahr, H., Falkenberg, M., Larsson, N. G., Jakobs, S. Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).
- Beinlich, F., Drees, C., Piehler, J., Busch, K. Shuttling of PINK1 between Mitochondrial Microcompartments Resolved by Triple-Color Superresolution Microscopy. ACS chemical biology. 10 (9), 1970-1976 (2015).
- Shim, S., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).
- Sbalzarini, I., Mezzacasa, A., Helenius, A., Koumoutsakos, P. Effects of Organelle Shape on Fluorescence Recovery after Photobleaching. Biophysical Journal. 89 (3), 1482-1492 (2005).
- Reits, E., Neefjes, J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nature Cell Biology. 3 (6), E145-E147 (2001).
- Goehring, N., Chowdhury, D., Hyman, A., Grill, S. FRAP Analysis of Membrane-Associated Proteins: Lateral Diffusion and Membrane-Cytoplasmic Exchange. Biophysical Journal. 99 (8), 2443-2452 (2010).
- Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications. Cold Spring Harbor protocols. 2014 (7), 709-725 (2014).
- Sukhorukov, V., Dikov, D., Busch, K., Strecker, V., Wittig, I., Bereiter-Hahn, J. Determination of protein mobility in mitochondrial membranes of living cells. Biochimica et biophysica acta. 1798 (11), 2022-2032 (2010).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Graham, F. L., van der Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52 (2), 456-467 (1973).
- Wedeking, T., et al. Spatiotemporally Controlled Reorganization of Signaling Complexes in the Plasma Membrane of Living Cells. Small. 11 (44), 5912-5918 (2015).
- Mironov, S. L., Ivannikov, M. V., Johansson, M. [Ca2+]i signaling between mitochondria and endoplasmic reticulum in neurons is regulated by microtubules. From mitochondrial permeability transition pore to Ca2+-induced Ca2+ release. J Biol Chem. 280 (1), 715-721 (2005).
- Poot, M., et al. Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains. J Histochem Cytochem. 44 (12), 1363-1372 (1996).
- Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells (vol 5, pg 159). Nature Methods. 5 (5), 455 (2008).
- Elmokadem, A., Yu, J. Optimal Drift Correction for Superresolution Localization Microscopy with Bayesian Inference. Biophys J. 109 (9), 1772-1780 (2015).
- Barlag, B., et al. Single molecule super-resolution imaging of proteins in living Salmonella enterica using self-labelling enzymes. Sci Rep. 6, 31601 (2016).
- Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
- Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy. Nat Methods. 7 (5), 377-381 (2010).
- Jin, S., Youle, R. J. PINK1- and Parkin-Mediated Mitophagy at a Glance. Journal of Cell Science. 125, 795-799 (2013).
- Yamano, K., Youle, R. J. PINK1 is degraded through the N-end rule pathway. Autophagy. 9 (11), 1758-1758 (2013).
- Wiedemann, N., et al. Machinery for protein sorting and assembly in the mitochondrial outer membrane. Nature. 424 (6948), 565-571 (2003).
- Thompson, R., Larson, D., Webb, W. Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
