Многоцветные локализации микроскопия одного мембранных белков в органеллами живой Mammalian клеток
Summary
Здесь мы представляем протокол для локализации многоцветные одного мембранных белков в органеллы живых клеток. Чтобы прикрепить флуорофоров, используются самомаркируемыми белки. Белки, расположенных в различных оболочек отсеков же органеллы, могут быть локализованы с точностью ~ 18 Нм.
Abstract
Знания о локализации белков в клеточном subcompartments важно понять их конкретные функции. Здесь мы представляем супер резолюции технику, которая позволяет для определения microcompartments, которые доступны для белков, генерируя локализации и отслеживания карты этих белков. Кроме того при локализации многоцветные микроскопии, локализации и отслеживания профили белков в разных subcompartments получаются одновременно. Техника для живых клеток и основан на повторяющихся изображений одного мобильного мембранных белков. Протеинов интереса генетически сливается с конкретными, так называемые самомаркируемыми Теги. Эти теги являются ферменты, которые реагируют с субстрат на основе ковалентных. Конъюгированных эти субстраты являются флуоресцентных красителей. Реакции Энзим тегами белков с флуоресценцией помечены субстратов результаты в обозначенные протеины. Здесь тетраметилродамина (ПМР) и родамин кремния (сэр) используются в качестве Краски люминесцентные, флуоресцентные, придает субстраты ферментов. С помощью концентрации субстрата в личку к Нм, югу стехиометрическим маркировки достигается, что приводит к различных сигналов. Эти сигналы локализованы с ~ 15 – 27 Нм точность. Техника позволяет многоцветные изображения одного молекул, согласно которой количество цветов ограничивается доступных проницаемой мембраны красителей и репертуар самомаркируемыми ферментов. Мы покажем возможности техники путем определения локализации контроля качества фермента (Pten)-индуцированной киназы 1 (PINK1) в различных отсеках митохондриальной во время его обработки в отношении других мембранных белков. Тест на истинный физических взаимодействий между по-разному помечены одной белки одной молекулы лад или совместное отслеживание ограничен, хотя, потому что низкий маркировка степени уменьшить вероятность для имеющих двух прилегающих белки, помечены в то же время. В то время как техника является сильным для визуализации белков в отсеках мембраны, в большинстве случаев это не целесообразно определить локализация мобильных растворимые белки.
Introduction
Целью настоящего Протокола является предоставить метод обработки изображений для локализации и отслеживания одного мембранных белков внутри живых клеток. Мы называем этот метод отслеживания и локализации микроскопии (TALM)1,2. Как стохастические оптической микроскопии реконструкции (шторм)3 и микроскопии флуоресцирования Photoactivation локализации ((F PALM))4,5TALM это способ локализации одной молекулы основе флуоресценции. Однако она отличается в том, что мобильность мембранных белков в сочетании с повторяющихся изображений одного и того же надписью молекулы в разных позициях показывает microcompartment, который доступен для мобильных белка. Другими словами возможности локализации протеина устанавливаются архитектура органелл и мобильность белок1. Метод является дополнением к различных других суперразрешением методы6,7,8 , потому что она показывает, локализации и траектории карты визуализации мобильных белков. Маркировки основана на использовании генетически синтез белков, которые per se не флуоресцентные. Эти протеины сплавливания являются самомаркируемыми ферменты, которые реагируют ковалентно с подложкой, конъюгированных с красителем. Эта процедура имеет то преимущество, что маркировка степени может быть под контролем количество добавлен субстрата. Кроме того она позволяет изменять цвет флуоресценции, в зависимости от выбранной конъюгированных красителя. Несколько самомаркируемыми фермента теги являются доступны9. Еще одно преимущество использования самомаркируемыми фермента теги, что конъюгированных красители обычно являются более стабильными и ярче, чем флуоресцентные белки1 индивидуальных белков и поэтому может быть записано больше и более точно до тех пор, пока они являются беленой. Это позволяет для записи траекторий мобильных белков и извлечения коэффициенты диффузии10,11.
Здесь мы продемонстрировать возможности TALM с митохондриальных мембранных белков, но он также может применяться для других интра – и загородный cellular мембранных белков, включая различных клеточных типов12,13. Мы показываем, что многоцветные TALM далее позволяет одновременное различия белков в различных subcompartments в дополнения существующих суперразрешением флуоресцентной микроскопии методы14,15, 16. TALM совместим с живой клетки изображений17. Фото физика выбранной rhodamines тетраметилродамина (ПМР) и кремний-Rhodamien (SiR), в частности их яркость и стабильности, позволяет записывать один мембранных белков через несколько кадров, предоставление карт локализации (и траектории). Однако TALM ограничен для локализации растворимые белки с высокой диффузионной коэффициентами, поскольку размытие движения является слишком высоким и собранных фотонов в кадре, являются слишком низкими для правильной локализации. Кроме того TALM требует меньше энергии возбуждения, чем например шторм или стимулировали выбросов истощения (интереса) микроскопия6,7, уменьшая фототоксических эффекты. Это важно, поскольку фототоксических стресс часто влияет на organellar морфология18 и, таким образом, мобильность анализа19. В целом, мы представляем многоцветные TALM в живых клетках как технику, которая заполняет пробел между методами микроскопии локализации шторм/интереса/PALM (F) и методов, которые анализируют белка мобильности как флуоресценции восстановления после Фотообесцвечивание (FRAP)20 ,21, флуоресценции корреляции спектроскопии (FCS)22и флуоресценции крест корреляция спектроскопии (FCCS)11,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь был представлен метод двойной цвет одной молекулы локализация мобильных мембранных белков. После протокол, мембранные белки сплавлены к самомаркируемыми белки, которые реагируют с красителями родамин ПМР и сэр, сопряженных с их соответствующих субстратов. Родамин краски яркие ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить группу биофизики и Jacob Piehler в университете Оснабрюка для постоянной поддержки, Владислав Kohl для оказания технической помощи и подготовке материала и Правление CellNanOs для предоставления микроскопы для использования. Проект финансировался SFB 944.
Materials
| (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M) (HEPES) | Biochrom | #1104E | |
| DC1: Dichroid beam splitter | Chroma | 640 dcxr | NC506031 |
| DC2: Polychroic Mirror, beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/640rpc | discontinued |
| Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x (w/o Ca & Mg) | Sigma-Aldrich & Co. | #RNBF8311 | |
| Earle´s MEM without phenol red, without L-Glutamine and without NaHCO3 containing 1% FBS, 0.1% HEPES, 0.1% NEAA, 0.1% Alanyl-L-Glutamine and 34.78% sodium hydrogen carbonate (NaHCO3 0.75g/l) | Imaging medium | ||
| Earle´s minimum essential medium (MEM) with phenol red, containing 1% Fetal Bovine Serum Superior (FBS), 0.1% HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M), and 0.1% non-essential amino acids (NEAA) | Growth medium | ||
| EF: Emission filter quadbandpass | AHF analysentechnik | F72-866 | Brightline HC 446 nm/523 nm/600 nm/677 nm |
| EMCCD camera | Andor | Andor iXON 897 | EMCCD camera |
| Emission filter QuadView filter cubes, orange | AHF analysentechnik | F39-637 | bandpass 582 – 619 nm |
| Emission filter QuadView filter cubes, red | Chroma | bandpass 655 – 725 nm (HQ 690/70) | |
| FBS (Fetal bovine serum) superior | Biochrom | S0615 | |
| Fluorescent beads: TetraSpeck™ Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red | Thermo Fisher Scientific | T7279 | fluorescent microspheres |
| Glutamine | Biochrom | #0951C | |
| HeLa cells | DSMZ | ACC-57 | Cervical carcinoma cells from patient Henrietta Lacks |
| Hela cells CI::paGFP, stable | Muster et al., PLOSOne 2010 | ||
| Hela cells CV g::Halo7-Tag, stable | Appelhans et al., NanoLett 2012 | ||
| Hela cells Tom20::Halo7-Tag, stable | Appelhans et al., NanoLett 2012 | ||
| Image splitter | Photometrics | Dual-View QV2 | image splitter emission |
| Imaging processing software | ImageJ2 / Fiji | freeware | |
| Immersion Oil – ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45) | Carl Zeiss Jena GmbH | 444960-0000-000 | |
| Inverted epifluorescence microscope | Olympus IX-71/73/83 | ||
| Laser 561 nm, 200 mW | CrystaLaser | CL-561-200 | 561 nm emission |
| Laser 642 nm, 140 mW | Omicron | Luxx-642-140 | 642 nm emission |
| MATLAB | MathWorks | version R2013a | |
| MEM with Earle's Balanced Salt Solution 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine w/o PR | Biochrom | FG-0385 | |
| MEM with Earle's Balanced Salt Solution with 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine, Phenolred | Biochrom | FG-0325 | |
| MitoTracker® Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | dye |
| MitoTracker® Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | dye |
| Multi-mode-optical polarization maintaining monomode fiber | Pointsource/Qioptiq | KineFLEX | |
| NHS-PEG-MAL, Rapp Polymer | Rapp Polymere GmbH Tübingen | coverslip coating | |
| non-essential amino acids (NEAA) | Biochrom | #0802E | |
| PEG 800 (Polyethylene glycol) 10 % | Carl Roth GmbH | Art No. 0263.1 | coverslip coating |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | #0122E | |
| Plasmid for PINK1-Halo7-Tag expression | Beinlich et al., ACS Chemical Biology 2015 | ||
| Poly-L-lysine (1.2 mg/ml) | Sigma-Aldrich & Co. | Cat. No.P9155 | coverslip coating |
| RGD Peptide (Ac-CGRGDS-COOH) | Coring System Diagnostix GmbH, Gernsheim | coverslip coating / Intergrin receptor motif | |
| Silicon Rhodamine linked to HaloTag®-Ligand (SiRHTL) | personal gift from Kai Johnson | dye | |
| Software analysis plugin | self-written C. P. Richter, Biophysik Osnabrück | SLIMFAST 16g | |
| Tetramethylrhodamine / SNAP-Cell® TMR-Star linked to SNAP-Ligand (TMRstar) | New England Biolab® | S9105S | dye |
| Tetramethylrhodamine linked to HaloTag®-Ligand (TMRHTL) | Promega | G8251 | dye |
| TIRF condensor | Olympus | Cell^TIRF MITICO System | TIRF condensor |
| TIRF microscope controlling software | Olympus cellSens 1.12 | ||
| TIRF objective | Olympus | 150x oil objective (N.A. 1.45; Olympus UAPO) | |
| Trypsin/EDTA 10x | Biochrom | #0266 | |
| Water H2O 99,5 % Rotipuran® Low organic | Carl Roth GmbH | Art. No. HN57.1 |
References
- Appelhans, T., Richter, C., Wilkens, V., Hess, S., Piehler, J., Busch, K. Nanoscale organization of mitochondrial microcompartments revealed by combining tracking and localization microscopy. Nano Letters. 12 (2), 610-616 (2012).
- Appelhans, T., Busch, K. Single Molecule Tracking and Localization of Mitochondrial Protein Complexes in Live Cells. Methods Mol Biol. 1567, 273-291 (2017).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Gould, T. J., Verkhusha, V. V., Hess, S. T. Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy. Nat Protoc. 4 (3), 291-308 (2009).
- Pennacchietti, F., Gould, T. J., Hess, S. T. The Role of Probe Photophysics in Localization-Based Superresolution Microscopy. Biophys J. 113 (9), 2037-2054 (2017).
- Wegel, E., Göhler, A., Lagerholm, B. C., Wainman, A. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific reports. , (2016).
- Pellett, P., et al. Two-color STED microscopy in living cells. Biomedical Optics Express. 2 (8), (2011).
- Ishigaki, M., et al. STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells. Mitochondrion. 28, 79 (2016).
- Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy. Scientific Reports. 5, 17740 (2015).
- Sergé, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nat Methods. 5 (8), (2008).
- Appelhans, T., Busch, K. B. Dynamic imaging of mitochondrial membrane proteins in specific sub-organelle membrane locations. Biophysical reviews. 9 (4), 345-352 (2017).
- Wilmes, S., et al. Triple-color super-resolution imaging of live cells: resolving submicroscopic receptor organization in the plasma membrane. Angewandte Chemie. 51 (20), 4868-4871 (2012).
- Niewidok, B., et al. Single-molecule imaging reveals dynamic biphasic partition of RNA-binding proteins in stress granules. J Cell Biol. , (2018).
- Wurm, C. A., Jakobs, S. Differential protein distributions define two sub-compartments of the mitochondrial inner membrane in yeast. FEBS Lett. 580 (24), 5628-5634 (2006).
- Schmidt, R., Wurm, C. A., Punge, A., Egner, A., Jakobs, S., Hell, S. W. Mitochondrial cristae revealed with focused light. Nano Lett. 9 (6), 2508-2510 (2009).
- Kukat, C., Wurm, C. A., Spahr, H., Falkenberg, M., Larsson, N. G., Jakobs, S. Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).
- Beinlich, F., Drees, C., Piehler, J., Busch, K. Shuttling of PINK1 between Mitochondrial Microcompartments Resolved by Triple-Color Superresolution Microscopy. ACS chemical biology. 10 (9), 1970-1976 (2015).
- Shim, S., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).
- Sbalzarini, I., Mezzacasa, A., Helenius, A., Koumoutsakos, P. Effects of Organelle Shape on Fluorescence Recovery after Photobleaching. Biophysical Journal. 89 (3), 1482-1492 (2005).
- Reits, E., Neefjes, J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nature Cell Biology. 3 (6), E145-E147 (2001).
- Goehring, N., Chowdhury, D., Hyman, A., Grill, S. FRAP Analysis of Membrane-Associated Proteins: Lateral Diffusion and Membrane-Cytoplasmic Exchange. Biophysical Journal. 99 (8), 2443-2452 (2010).
- Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications. Cold Spring Harbor protocols. 2014 (7), 709-725 (2014).
- Sukhorukov, V., Dikov, D., Busch, K., Strecker, V., Wittig, I., Bereiter-Hahn, J. Determination of protein mobility in mitochondrial membranes of living cells. Biochimica et biophysica acta. 1798 (11), 2022-2032 (2010).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Graham, F. L., van der Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52 (2), 456-467 (1973).
- Wedeking, T., et al. Spatiotemporally Controlled Reorganization of Signaling Complexes in the Plasma Membrane of Living Cells. Small. 11 (44), 5912-5918 (2015).
- Mironov, S. L., Ivannikov, M. V., Johansson, M. [Ca2+]i signaling between mitochondria and endoplasmic reticulum in neurons is regulated by microtubules. From mitochondrial permeability transition pore to Ca2+-induced Ca2+ release. J Biol Chem. 280 (1), 715-721 (2005).
- Poot, M., et al. Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains. J Histochem Cytochem. 44 (12), 1363-1372 (1996).
- Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells (vol 5, pg 159). Nature Methods. 5 (5), 455 (2008).
- Elmokadem, A., Yu, J. Optimal Drift Correction for Superresolution Localization Microscopy with Bayesian Inference. Biophys J. 109 (9), 1772-1780 (2015).
- Barlag, B., et al. Single molecule super-resolution imaging of proteins in living Salmonella enterica using self-labelling enzymes. Sci Rep. 6, 31601 (2016).
- Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
- Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy. Nat Methods. 7 (5), 377-381 (2010).
- Jin, S., Youle, R. J. PINK1- and Parkin-Mediated Mitophagy at a Glance. Journal of Cell Science. 125, 795-799 (2013).
- Yamano, K., Youle, R. J. PINK1 is degraded through the N-end rule pathway. Autophagy. 9 (11), 1758-1758 (2013).
- Wiedemann, N., et al. Machinery for protein sorting and assembly in the mitochondrial outer membrane. Nature. 424 (6948), 565-571 (2003).
- Thompson, R., Larson, D., Webb, W. Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
