बहु रंग स्थानीयकरण एकल झिल्ली प्रोटीन की Organelles लाइव स्तनधारी कोशिकाओं में माइक्रोस्कोपी
Summary
यहाँ, हम लाइव कोशिकाओं के organelles में एकल झिल्ली प्रोटीन के बहु रंग स्थानीयकरण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । fluorophores संलग्न करने के लिए, स्व-लेबलिंग प्रोटीन का उपयोग किया जाता है । प्रोटीन, एक ही organelle के विभिन्न झिल्ली डिब्बों में स्थित है, की एक परिशुद्धता के साथ स्थानीयकृत किया जा सकता ~ 18 एनएम.
Abstract
सेलुलर उपडिब्बों में प्रोटीन के स्थानीयकरण के बारे में ज्ञान उनके विशिष्ट समारोह को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । यहां, हम एक सुपर संकल्प तकनीक है कि microcompartments है कि प्रोटीन के लिए स्थानीयकरण पैदा करने और इन प्रोटीन के नक्शे पर नज़र रखने के लिए सुलभ है के निर्धारण के लिए अनुमति देता है उपस्थित । इसके अलावा, बहु रंग स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी द्वारा, स्थानीयकरण और विभिन्न उपडिब्बों में प्रोटीन की ट्रैकिंग प्रोफाइल एक साथ प्राप्त कर रहे हैं । तकनीक जीवित कोशिकाओं के लिए विशिष्ट है और एकल मोबाइल झिल्ली प्रोटीन के दोहराव इमेजिंग पर आधारित है । ब्याज के प्रोटीन आनुवंशिक रूप से विशिष्ट, तथाकथित स्वयं लेबलिंग टैग के साथ जुड़े हुए हैं । इन टैग एंजाइमों कि एक आबंध तरीके से एक सब्सट्रेट के साथ प्रतिक्रिया कर रहे हैं । इन सब्सट्रेट करने के लिए संयुग्मित फ्लोरोसेंट रंजक हैं । एंजाइम की प्रतिक्रिया-प्रोटीन लेबल में सब्सट्रेट परिणाम लेबल प्रतिदीप्ति के साथ- यहां, Tetramethylrhodamine (टीएमआर) और सिलिकॉन Rhodamine (सर) एंजाइमों के सब्सट्रेट से जुड़ी फ्लोरोसेंट रंजक के रूप में उपयोग किया जाता है । प्रधानमंत्री को एनएम रेंज में सब्सट्रेट सांद्रता का उपयोग करके, उप-stoichiometric लेबलिंग कि विशिष्ट संकेतों में परिणाम प्राप्त किया है । इन संकेतों के साथ स्थानीयकृत रहे हैं ~ 15 – 27 एनएम परिशुद्धता. तकनीक बहु के लिए अनुमति देता है एक अणु के रंग इमेजिंग, जिससे रंग की संख्या उपलब्ध झिल्ली-पारगंय रंजक और स्वयं की प्रदर्शनों लेबल एंजाइमों द्वारा सीमित है । हम गुणवत्ता नियंत्रण एंजाइम (Pten)-प्रेरित कळेनासे 1 (PINK1) के स्थानीयकरण का निर्धारण करके तकनीक की व्यवहार्यता दिखाने के अंय झिल्ली प्रोटीन के संबंध में अपनी प्रोसेसिंग के दौरान विभिंन mitochondrial डिब्बों में । एक अणु झल्लाहट या सह-ट्रैकिंग द्वारा अलग लेबल एकल प्रोटीन के बीच सच शारीरिक बातचीत के लिए परीक्षण प्रतिबंधित है, हालांकि, क्योंकि कम लेबलिंग डिग्री दो आसंन एक ही समय में लेबल प्रोटीन होने के लिए संभावना कम । जबकि तकनीक झिल्ली डिब्बों में इमेजिंग प्रोटीन के लिए मजबूत है, ज्यादातर मामलों में यह उचित नहीं है अत्यधिक मोबाइल घुलनशील प्रोटीन के स्थानीयकरण का निर्धारण ।
Introduction
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य स्थानीयकरण और लाइव कोशिकाओं के अंदर एकल झिल्ली प्रोटीन ट्रैक करने के लिए एक इमेजिंग विधि प्रदान करने के लिए है । हम इस विधि पर नज़र रखने और स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (TALM)1,2कहते हैं । जैसे Stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (स्टॉर्म)3 और प्रतिदीप्ति Photoactivation स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी ((एफ) पाम)4,5, TALM एक अणु है आधारित प्रतिदीप्ति स्थानीयकरण तकनीक । हालांकि, यह अलग स्थिति में एक ही लेबल अणु के दोहराव इमेजिंग के साथ संयोजन में झिल्ली प्रोटीन की गतिशीलता कि मोबाइल प्रोटीन के लिए सुलभ है कि microcompartment से पता चलता है कि रास्ते में अलग है । दूसरे शब्दों में, प्रोटीन के संभावित स्थानीयकरण organelle की वास्तुकला द्वारा और प्रोटीन की गतिशीलता द्वारा निर्धारित कर रहे हैं1. विधि विभिंन अंय सुपर संकल्प तकनीक6,7,8 के पूरक है क्योंकि यह स्थानीयकरण और इमेजिंग मोबाइल प्रोटीन द्वारा पथ नक्शे से पता चलता है । लेबल आनुवंशिक रूप से इंजीनियर फ्यूजन प्रोटीन है कि एसई प्रति गैर फ्लोरोसेंट का उपयोग कर रहा है पर आधारित है । ये फ्यूजन प्रोटीन स्वयं लेबलिंग एंजाइमों कि एक डाई करने के लिए एक सब्सट्रेट संयुग्मित के साथ covalently प्रतिक्रिया कर रहे हैं. इस प्रक्रिया का लाभ यह है कि लेबलिंग की डिग्री जोड़ा सब्सट्रेट की राशि से नियंत्रित किया जा सकता है. इसके अलावा, यह प्रतिदीप्ति के रंग भिंन है, चुना संयुग्मित डाई पर निर्भर करता है की अनुमति देता है । कई स्वयं लेबलिंग एंजाइम-टैग उपलब्ध9हैं । स्वयं का उपयोग कर का एक और लाभ-लेबलिंग एंजाइम-टैग है, कि संयुग्मित रंजक आमतौर पर अधिक स्थिर और फ्लोरोसेंट प्रोटीन1 और व्यक्तिगत प्रोटीन से उज्जवल है इसलिए अब और अधिक ठीक दर्ज किया जा सकता है जब तक वे ब्लीच कर रहे हैं । यह मोबाइल प्रोटीन की गति और प्रसार की निकासी गुणांक10,11की रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देता है ।
यहाँ, हम mitochondrial झिल्ली प्रोटीन के साथ TALM की व्यवहार्यता का प्रदर्शन, लेकिन यह भी अन्य अंतर और अतिरिक्त सेलुलर झिल्ली प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता, विभिन्न कोशिका प्रकार12,13सहित. हम बताते है कि बहु रंग TALM आगे के लिए पूरक में विभिंन उपडिब्बों में प्रोटीन के एक साथ अंतर के लिए अनुमति देता है मौजूदा सुपर संकल्प प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीक14,15, 16. TALM लाइव सेल इमेजिंग17के साथ संगत है । फोटो-चुना rhodamines Tetramethylrhodamine (टीएमआर) और सिलिकॉन के भौतिकी-Rhodamien (सर), विशेष रूप से उनकी चमक और स्थिरता में, स्थानीयकरण (और पथ) नक्शे प्रदान करने के लिए कई फ्रेम पर एकल झिल्ली प्रोटीन रिकॉर्ड करने के लिए अनुमति देता है । हालांकि, TALM उच्च प्रसार गुणांक के साथ घुलनशील प्रोटीन के स्थानीयकरण के लिए सीमित है क्योंकि प्रस्ताव धुंधला बहुत अधिक है और प्रति फ्रेम एकत्र फोटॉनों उचित स्थानीयकरण के लिए बहुत कम हैं । इसके अलावा, TALM उदाहरण के तूफान या उत्तेजित उत्सर्जन कम करने (STED) माइक्रोस्कोपी6,7, phototoxic प्रभाव को कम करने के लिए की तुलना में उत्तेजना शक्ति की आवश्यकता है । यह महत्वपूर्ण है, क्योंकि phototoxic तनाव अक्सर organellar आकृति विज्ञान18 को प्रभावित करता है और इस प्रकार गतिशीलता विश्लेषण19. संक्षेप में, हम वर्तमान बहु-रंग TALM एक तकनीक है कि स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी तरीकों तूफान के बीच एक अंतर भरता है के रूप में रहने वाले कोशिकाओं में STED/(च) पाम और तकनीक है कि प्रोटीन गतिशीलता का विश्लेषण जैसे प्रतिदीप्ति वसूली के बाद photobleaching (frap है)20 ,२१, प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (FCS)२२, तथा प्रतिदीप्ति परस्पर सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (FCCS)११,२३.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, मोबाइल झिल्ली प्रोटीन के दोहरे रंग एकल अणु स्थानीयकरण के लिए एक तकनीक प्रस्तुत किया गया था । प्रोटोकॉल के बाद, झिल्ली प्रोटीन rhodamine रंजक टीएमआर और उनके संबंधित सब्सट्रेट करने के लिए सर संयुग्मित क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक के लिए सतत समर्थन, तकनीकी सहायता और सामग्री की तैयारी के लिए Wladislaw कोल के लिए Osnabrück विश्वविद्यालय में, और उपयोग के लिए सूक्ष्मदर्शी प्रदान करने के लिए CellNanOs बोर्ड के लिए भौतिकी समूह और याकूब Piehler शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । परियोजना SFB ९४४ द्वारा वित्त पोषित किया गया ।
Materials
| (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M) (HEPES) | Biochrom | #1104E | |
| DC1: Dichroid beam splitter | Chroma | 640 dcxr | NC506031 |
| DC2: Polychroic Mirror, beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/640rpc | discontinued |
| Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x (w/o Ca & Mg) | Sigma-Aldrich & Co. | #RNBF8311 | |
| Earle´s MEM without phenol red, without L-Glutamine and without NaHCO3 containing 1% FBS, 0.1% HEPES, 0.1% NEAA, 0.1% Alanyl-L-Glutamine and 34.78% sodium hydrogen carbonate (NaHCO3 0.75g/l) | Imaging medium | ||
| Earle´s minimum essential medium (MEM) with phenol red, containing 1% Fetal Bovine Serum Superior (FBS), 0.1% HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M), and 0.1% non-essential amino acids (NEAA) | Growth medium | ||
| EF: Emission filter quadbandpass | AHF analysentechnik | F72-866 | Brightline HC 446 nm/523 nm/600 nm/677 nm |
| EMCCD camera | Andor | Andor iXON 897 | EMCCD camera |
| Emission filter QuadView filter cubes, orange | AHF analysentechnik | F39-637 | bandpass 582 – 619 nm |
| Emission filter QuadView filter cubes, red | Chroma | bandpass 655 – 725 nm (HQ 690/70) | |
| FBS (Fetal bovine serum) superior | Biochrom | S0615 | |
| Fluorescent beads: TetraSpeck™ Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red | Thermo Fisher Scientific | T7279 | fluorescent microspheres |
| Glutamine | Biochrom | #0951C | |
| HeLa cells | DSMZ | ACC-57 | Cervical carcinoma cells from patient Henrietta Lacks |
| Hela cells CI::paGFP, stable | Muster et al., PLOSOne 2010 | ||
| Hela cells CV g::Halo7-Tag, stable | Appelhans et al., NanoLett 2012 | ||
| Hela cells Tom20::Halo7-Tag, stable | Appelhans et al., NanoLett 2012 | ||
| Image splitter | Photometrics | Dual-View QV2 | image splitter emission |
| Imaging processing software | ImageJ2 / Fiji | freeware | |
| Immersion Oil – ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45) | Carl Zeiss Jena GmbH | 444960-0000-000 | |
| Inverted epifluorescence microscope | Olympus IX-71/73/83 | ||
| Laser 561 nm, 200 mW | CrystaLaser | CL-561-200 | 561 nm emission |
| Laser 642 nm, 140 mW | Omicron | Luxx-642-140 | 642 nm emission |
| MATLAB | MathWorks | version R2013a | |
| MEM with Earle's Balanced Salt Solution 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine w/o PR | Biochrom | FG-0385 | |
| MEM with Earle's Balanced Salt Solution with 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine, Phenolred | Biochrom | FG-0325 | |
| MitoTracker® Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | dye |
| MitoTracker® Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | dye |
| Multi-mode-optical polarization maintaining monomode fiber | Pointsource/Qioptiq | KineFLEX | |
| NHS-PEG-MAL, Rapp Polymer | Rapp Polymere GmbH Tübingen | coverslip coating | |
| non-essential amino acids (NEAA) | Biochrom | #0802E | |
| PEG 800 (Polyethylene glycol) 10 % | Carl Roth GmbH | Art No. 0263.1 | coverslip coating |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | #0122E | |
| Plasmid for PINK1-Halo7-Tag expression | Beinlich et al., ACS Chemical Biology 2015 | ||
| Poly-L-lysine (1.2 mg/ml) | Sigma-Aldrich & Co. | Cat. No.P9155 | coverslip coating |
| RGD Peptide (Ac-CGRGDS-COOH) | Coring System Diagnostix GmbH, Gernsheim | coverslip coating / Intergrin receptor motif | |
| Silicon Rhodamine linked to HaloTag®-Ligand (SiRHTL) | personal gift from Kai Johnson | dye | |
| Software analysis plugin | self-written C. P. Richter, Biophysik Osnabrück | SLIMFAST 16g | |
| Tetramethylrhodamine / SNAP-Cell® TMR-Star linked to SNAP-Ligand (TMRstar) | New England Biolab® | S9105S | dye |
| Tetramethylrhodamine linked to HaloTag®-Ligand (TMRHTL) | Promega | G8251 | dye |
| TIRF condensor | Olympus | Cell^TIRF MITICO System | TIRF condensor |
| TIRF microscope controlling software | Olympus cellSens 1.12 | ||
| TIRF objective | Olympus | 150x oil objective (N.A. 1.45; Olympus UAPO) | |
| Trypsin/EDTA 10x | Biochrom | #0266 | |
| Water H2O 99,5 % Rotipuran® Low organic | Carl Roth GmbH | Art. No. HN57.1 |
References
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