के लिए अनुकूलित स्क्रैच परख में इन विट्रो एक स्वचालित ऑप्टिकल कैमरा के साथ सेल प्रवास के परीक्षण
Summary
यहां हम एक प्रक्रिया का वर्णन करने के लिए एक स्वचालित ऑप्टिकल कैमरा माइक्रोस्कोप के साथ इन विट्रो में सेल प्रवास का परीक्षण । खरोंच परख व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है, जहां खरोंच के बंद करने के लिए एक निर्धारित अवधि के बाद है । ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप सेल प्रवास के भरोसेमंद और सस्ते पता लगाने में सक्षम बनाता है ।
Abstract
सेल प्रवासन एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है कि स्वास्थ्य के कई पहलुओं को प्रभावित करता है, ऐसे घाव हीलिंग और कैंसर के रूप में, और यह है, इसलिए तरीकों के विकास के लिए प्रवास के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है । खरोंच परख लंबे इन विट्रो विधि में सबसे आम किया गया है विरोधी के साथ यौगिकों का परीक्षण और समर्थक अपनी कम लागत और सरल प्रक्रिया की वजह से प्रवास गुण । हालांकि, एक अक्सर-परख की समस्या की सूचना दी खरोंच के किनारे भर में कोशिकाओं का संचय है । इसके अलावा, परख से डेटा प्राप्त करने के लिए, अलग जोखिम की छवियों को सटीक एक ही स्थान पर समय की अवधि में लिया जाना चाहिए प्रवास के आंदोलनों की तुलना । विभिंन विश्लेषण कार्यक्रमों के लिए खरोंच बंद का वर्णन किया जा सकता है, लेकिन वे गहन श्रम, गलत कर रहे हैं, और तापमान परिवर्तन के चक्र बलों । इस अध्ययन में, हम प्रवास प्रभाव के परीक्षण के लिए एक अनुकूलित विधि प्रदर्शित करता है, उदाहरण के साथ प्राकृतिक रूप से होने वाली प्रोटीन मानव-और गोजातीय-लैक्टोफेरिन और उनके N-टर्मिनल पेप्टाइड Lactoferricin पर उपकला कोशिका लाइन HaCaT. एक महत्वपूर्ण अनुकूलन को धोने और पंजाब में खरोंच है, जो बढ़त के साथ कोशिकाओं के aforementioned संचय समाप्त होता है । यह cations, जो keratinocyte सेल-सेल कनेक्शन पर एक प्रभाव है दिखाया गया है हटाने के द्वारा समझाया जा सकता है । प्रवास की सही पहचान सुनिश्चित करने के लिए, मीतोमयसीं सी, डीएनए संश्लेषण अवरोधक के साथ पूर्व इलाज, प्रोटोकॉल के लिए जोड़ा गया था । अंत में, हम स्वचालित ऑप्टिकल कैमरा है, जो अत्यधिक तापमान चक्र, खरोंच बंद करने के विश्लेषण के साथ मैनुअल श्रम समाप्त, जबकि reproducibility पर सुधार और समय पर खरोंच के समान वर्गों के विश्लेषण सुनिश्चित करने का प्रदर्शन ।
Introduction
प्रवासन एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है कि कई शारीरिक पहलुओं को प्रभावित करता है । घाव भरने में, माइग्रेशन त्वचा के पुनः उपर्त्वचीकरण की सुविधा देता है । गैर घाव भरने में, इस तरह के जीर्ण घावों के रूप में, अवसरवादी जीवाणु घाव के संक्रमण का कारण है, और खुले घावों जीवाणु विकास और1,2के गठन के लिए आदर्श होते हैं । फिल्म प्रतिरोधी बैक्टीरिया है, जो हमारे आधुनिक समाज3के लिए सबसे बड़ा खतरों में से एक है के विकास के कारणों में से एक है । घाव भरने में, प्रतिरक्षा कोशिकाओं को इस फिल्म में प्रवेश नहीं कर सकते । कैंसर में, कैंसर कोशिकाओं के प्रवासन मेटास्टेसिस के एक निर्णायक कदम है, जो ठोस ट्यूमर के साथ रोगियों के लिए मौत का प्राथमिक कारण4,5है । इसलिए प्रवास का अध्ययन करने में सक्षम होना महत्वपूर्ण है ।
स्क्रैच परख अक्सर सेल माइग्रेशन परीक्षण करने के लिए प्रयोग किया जाता है क्योंकि यह सस्ता है और अनुयाई सेल लाइनों पर प्रदर्शन करने के लिए आसान है, जैसे fibroblast, endothelial, और उपकला सेल लाइनों6,7. आज, कई तरीकों8खरोंच प्रदर्शन के लिए मौजूद है, और विभिंन सामग्रियों के लिए इस्तेमाल किया जा रिपोर्ट किया गया है9toothpicks सहित, सेल खुरचनी10, पराबैंगनीकिरण11, और बिजली धाराओं12। सभी तरीकों के विभिंन पेशेवरों और विपक्ष है, और विधि सेल प्रकार, बजट, और विश्लेषण उपकरण के अनुसार पर फैसला किया जाना चाहिए । एक उदाहरण के रूप में, यदि प्रयुक्त कक्ष प्रकार कोटिंग, मैनुअल दबाव हटाने, जैसे एक दंर्तखोदनी या पिपेट टिप के साथ की आवश्यकता है, क्षेत्र के भीतर प्रवास को प्रभावित करेगा, एक अलग विधि का इस्तेमाल किया जाना चाहिए । इस अध्ययन में, हम मैनुअल स्क्रैप पर ध्यान दिया जाएगा ।
मैनुअल परिमार्जन के लिए एक नकारात्मक पक्ष आकार, खरोंच के आकार, और खरोंच के किनारों पर सेल के संचय की भिन्नता है । कई प्रोटोकॉल मौजूद है, और एक उच्च उद्धृत कागज13scratching के बाद वृद्धि की गति और/ इसके अतिरिक्त, प्रसार को कम करने के लिए कई विधियों का उपयोग किया गया है, चूंकि कक्षों के प्रसार को माइग्रेशन से प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता और इसलिए माइग्रेशन के गलत-सकारात्मक परिणाम दे सकते हैं । कुछ रिपोर्ट किए गए तरीके सीरम भुखमरी14 खरोंच और15सीरम की मात्रा को कम करने के पूर्ववर्ती हैं । हालांकि, इन तरीकों में से न तो यह सुनिश्चित कर सकते है कि वहां कोई प्रसार है । इसलिए, हम माइग्रेशन के सही परिणाम सुनिश्चित करने के लिए मीतोमयसीं C के साथ कक्षों के पूर्व-उपचार की रिपोर्ट करते हैं । मीतोमयसीं सी एक एंटीबायोटिक है जो डीएनए के साथ एक आबंध बांड का गठन करके डीएनए संश्लेषण को बाधित करता है, जो डीएनए को16से अलग करने से रोकता है । मीतोमयसीं सी के साथ पूर्व इलाज करके और scratching से पहले पंजाबियों के साथ धुलाई, अंतर के पाया बंद होने कोशिकाओं के सच प्रवास को दर्शाता है (चित्रा 1) ।
सभी पद्धतियों की एक विशेषता यह है कि एक प्रणाली के लिए17माइग्रेशन की प्रक्रिया का विश्लेषण करने की आवश्यकता है । एक आम और एक सस्ती विधि की प्रगति का विश्लेषण करने के लिए एक प्रकाश क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए पूर्व में खरोंच की छवियों को ले निर्धारित समय अंक, एक छवि सॉफ्टवेयर18,19में अंतर के बंद होने के विश्लेषण के बाद है । इस विधि समय लेने वाली है, अविश्वसनीय के साथ एक ही स्थान और ध्यान में तस्वीरें लेने का संबंध है, और तापमान परिवर्तन के कैमरे बलों के चक्र के लिए मशीन से आंदोलन करते हुए तस्वीरें ले रहे हैं । वर्तमान प्रवाह को मापने के द्वारा माइग्रेशन का पता लगाने के लिए अंय विधियां विकसित की गई हैं । वर्तमान परिवर्तन, कोशिकाओं के रूप में प्लेट पर अधिक स्थान है, जो प्रतिबाधा20में वृद्धि के रूप में पढ़ा है कवर. प्रतिबाधा को मापने के द्वारा, कोशिकाओं का वातावरण प्रभावित नहीं है, और विधि इसलिए गैर इनवेसिव माना जाता है. इस विधि सोने इलेक्ट्रोड, जो महंगे हैं के साथ विशेष प्लेटों पर निर्भर करता है, लेकिन वे सेलुलर पालन, प्रसार, प्रवास, और कोशिका मृत्यु के रूप में कई प्रक्रियाओं का पता लगाने के लिए सक्षम. इस विधि का एक बड़ा नुकसान यह है कि प्रतिबाधा माप सीधे माइग्रेशन इंगित नहीं करता है, जैसे कि तापमान के रूप में कारक प्रतिबाधा पर एक बड़ा प्रभाव पड़ता है. प्रतिबाधा में परिवर्तन सॉफ्टवेयर द्वारा समीक्षा नहीं कर रहे हैं कि कई कारकों के कारण हो सकता है, डेटा का विश्लेषण अधिक कठिन बना. इसलिए, दृश्य की कमी एक पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोप के लिए प्रवास की पुष्टि की आवश्यकता है ।
उपलब्ध तकनीकों के नकारात्मक पक्ष के कई काबू पाने के लिए, हम एक वास्तविक समय स्वचालित ऑप्टिकल कैमरा का उपयोग करें । ऑप्टिकल कैमरा एक लेंस, रोशनी इकाई, और एक डिजिटल कैमरा के साथ एक छोटे से मंच में एक उच्च प्रवाह माइक्रोस्कोप के साथ एक का पता लगाने प्रणाली है । यह एक सॉफ्टवेयर में निर्मित है, जो अंय बातों के बीच प्रवास और प्रसार परीक्षण कर सकते हैं । माइग्रेशन का पता लगाने के लिए, दो एल्गोरिदम का उपयोग वृद्धि और कोशिकाओं के माइग्रेशन कैनेटीक्स का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है, जिन्हें क्रमशः प्रसार और घाव भरने वाला विश्लेषण कहा जाता है. प्रसार विश्लेषण एक दो कदम छवि विभाजन एल्गोरिथ्म पर आधारित है जो कोशिका-आच्छादित क्षेत्रों (पीले रंग में दिखाया गया) और उन्नत हिस्टोग्राम विश्लेषण द्वारा खाली पृष्ठभूमि क्षेत्रों के बीच अंतर का पता लगाने के लिए बनावट विश्लेषण लागू करता है । घाव भरने विश्लेषण एक तीन कदम एल्गोरिथ्म है कि सेल monolayer का पता लगाता है पर आधारित है, घाव अंतर को रेखांकित, और अंतर चौड़ाई निर्धारित करता है । ये चरण उपयोगकर्ता-निर्धारित समय-बिंदुओं पर किए जाते हैं, और डेटा को कवर्ड क्षेत्र, अंतर चौड़ाई और अंतर क्षेत्र के रूप में प्रस्तुत किया जाता है. इस मशीन के महान लाभ में से एक यह है कि यह कैमरा21के कोण की वजह से तरल के माध्यम से अनुयाई कोशिकाओं की इमेजिंग सक्षम बनाता है । कैमरा lenstakes झुकाव छवियों है कि एक जेड के ढेर के लिए अनुमानित कर रहे है एक z-विमान को यह सुनिश्चित करना है कि चित्रों में ध्यान केंद्रित कर रहे है उत्पंन (चित्रा 2) । z-स्टैक चित्र (उदा. ४०) की श्रृंखला के विलय से उत्पन्न होते हैं, जो घाव किनारे को सीधा ले जाते हैं, और पूरे घाव के पार । z-स्टैक सेल परत की गहराई के साथ ही घाव भर में एक में फोकस विमान पर कब्जा करने के लिए सक्षम बनाता है । इसके अलावा, छवियों की श्रृंखला एक साथ छवियों का एक वीडियो संग्रह करने के लिए रखा जा सकता है, एक बटन के क्लिक के साथ ।
हम keratinocyte सेल लाइन HaCaT में प्रवास का पता लगाने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है । हम लैक्टोफेरिन और उसके N-टर्मिनल पेप्टाइड, Lactoferricin, मनुष्यों और गायों से परीक्षण किया, प्रवास पर उनके प्रभाव का विश्लेषण के रूप में इन अणुओं रोगाणुरोधी और प्रतिरक्षा मॉडुलन22 अणुओं के रूप में कई आवेदन किया है करने के लिए दिखा दिया गया है , 23. चार यौगिकों अनुपचारित HaCaT कोशिकाओं की तुलना में थे और एपिडर्मल वृद्धि कारक (EGF) एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था.
Protocol
Representative Results
Discussion
विकास, घाव भरने, इम्यूनोलॉजी, और कैंसर के अध्ययन में प्रवास के महत्व के कई विभिंन तरीकों के लिए स्थानांतरण अध्ययन करने के लिए प्रेरित किया है । प्रवासन या तो विस्तार या कोशिकाओं द्वारा अंतर के बंद की अभ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
डेनिश स्वतंत्र अनुसंधान के लिए परिषद, प्रौद्योगिकी और उत्पादन, अनुदान #4005-00029
Materials
| oCelloScope | BioSense Solution ApS | Optical camera | |
| UniExplorer software | BioSense Solution ApS | (8.0.0.7144 (RL3)) | |
| HaCaT cell | Donated from Bispebjerg Hospital | ||
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | Medium for HaCaT |
| FBS | Gibco | 10270 | Fetal bovine serum |
| PBS | Gibco | D837 | Without Mg+ and Ca2+ |
| Pencillin-Streptomycin | Sigma | P0781 | Antibiotics |
| Trypsin (10x) | Sigma | T3924 | |
| Mitomycin C | Tocris | 3258 | Inhibits proliferation |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 677 180 | |
| Incubator | Panasonic | 37°C, 5% CO2 | |
| Hemocytometer | Assistent | Türk (0.1 mm) | |
| Pipet boy | Accu-Jet pro |
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