Оптимизированный скретч Assay в Vitro тестирования миграции клеток с автоматической оптической камеры
Summary
Здесь мы опишем процедуру тест ячейка миграции в пробирке с автоматической оптической камеры микроскопа. Царапинам assay широко используется где закрытие нуля следуют за определенный период. Оптический микроскоп обеспечивает надежный и дешевый обнаружение миграции клеток.
Abstract
Клетки миграция является важным процессом, который влияет на многие аспекты здоровья, таких как ранозаживляющее и рак, и он, таким образом, решающее значение для разработки методов для изучения миграции. Царапинам assay уже давно наиболее распространенных в vitro метод для проверки соединений с анти – и про migration свойства из-за его низкой стоимости и простая процедура. Однако часто сообщили проблема анализа — это совокупность клеток по всему краю нуля. Кроме того для получения данных от assay, изображения различных воздействий необходимо принять в течение времени в точно то же место для сравнения движения миграции. Различные анализа программы могут использоваться для описания скретч закрытия, но они являются трудоемким, неточной и силы циклам изменений температуры. В этом исследовании мы демонстрируем оптимизированный метод для тестирования миграции эффект, например с естественным белки лактоферрина человека и говядину и их N-терминальный пептидные Lactoferricin на линии эпителиальных клеток HaCaT. Решающее значение оптимизация является мыть и нуля в PBS, который устраняет вышеупомянутых накопления клеток вдоль края. Это можно объяснить путем удаления катионы, которые показали, чтобы иметь влияние на связи клеток кератиноцитов. Чтобы верно обнаружения миграции, предварительной обработки с митомицин C, ингибитор синтеза ДНК, был добавлен к протоколу. Наконец мы демонстрируем автоматизированных оптической камеры, которая исключает чрезмерное температурных циклов, ручной труд с нуля закрытия анализа, улучшения на воспроизводимость и обеспечивая анализ идентичных секций нуля с течением времени.
Introduction
Миграция является важным процессом, который влияет на некоторые физиологические аспекты. В заживлении ран, миграции облегчает повторное эпителизации кожи. В незаживающие раны, таких как хронические раны оппортунистических бактерии вызывают инфекции раны, и открытые раны идеальны для роста бактерий и образование биопленки1,2. Биопленки является одной из причин развития резистентных бактерий, который является одним из самых серьезных угроз для нашего современного общества3. В заживлении ран, иммунные клетки не могут проникнуть биопленки. В рак миграция раковых клеток является ключевой шаг метастазов, который является основной причиной смерти больных с солидными опухолями4,5. Таким образом важно иметь возможность изучения миграции.
Царапинам assay часто используется для тестирования миграции клеток, потому что это дешево и легко выполнять на линиях адэрентных клеток, фибробластов, эндотелия сосудов, и эпителиальных клеток линии6,7. Сегодня существует несколько методов для выполнения царапин8, и различные материалы были зарегистрированы для использования, включая зубочистки9, клетки скребки10, лазеры11и электрические токи12. Все методы имеют различные плюсы и минусы, и метод должно быть принято в соответствии с ячейки типа, бюджета и анализа инструмент. Например если тип используемой ячейки требует покрытия, удаление ручного давления, например с концом toothpick или пипетки, будет влиять на миграцию в пределах области, следует использовать другой метод. В этом исследовании мы сосредоточимся на ручное выскабливание.
Для ручной соскоб оборотная изменения размера, формы царапины и накопления клеток на краях нуля. Многие протоколы существуют, и высоко цитируется документ советует увеличена скорость и/или тщательного мытья после царапин13. Кроме того некоторые методы были использованы для сведения к минимуму распространения, поскольку распространение клетки не могут быть отделены от миграции и поэтому может дать ложно положительных результатов миграции. Некоторые сообщили, что методы являются сыворотки голода предшествующего нуля14 и уменьшается количество сыворотки15. Однако ни один из этих методов можно обеспечить, что нет никакого распространения. Таким образом мы приводим предварительной обработки клеток с митомицин C обеспечить реальные результаты миграции. Митомицин C — антибиотик, который подавляет синтез ДНК, формируя ковалентной связи с ДНК, которая предотвращает разделение16ДНК. Путем предварительной обработки с митомицин C и мойки с PBS до царапин, обнаруженных закрытия разрыва демонстрирует истинный миграции клеток (рис. 1).
Характерной особенностью всех методов является необходимость создания системы для анализа процесса миграции17. Общей и недорогой метод для анализа прогресса заключается в использовании микроскопом свет поле принять изображения нуля в предопределенное время точках, следуют анализ закрытия разрыва в образ программного обеспечения18,19. Этот метод является длительным, ненадежные отношении фотографировать на том же месте и фокус, и движение от инкубатора для камеры сил циклы изменения температуры во время съемки. Были разработаны другие методы для обнаружения миграции путем измерения тока. Текущие изменения, как клетки охватывают больше места на табличке, который читается как увеличение импеданса20. Путем измерения импеданса, средой клеток не влияет, и поэтому считается неинвазивный метод. Этот метод полагается на специализированных пластины с золотых электродов, которые являются дорогими, но они включить обнаружение многих процессов, таких как сотовый присоединению, распространения, миграции и гибели клеток. Большим недостатком этого метода является измерение импеданса не указывать непосредственно миграции, поскольку такие факторы, как температура имеют большое влияние на сопротивление. Изменения в сопротивление может быть вызвана несколько факторов, которые не проверены программного обеспечения, затрудняет анализ данных. Таким образом отсутствие визуализация требует обычных световой микроскоп для проверки миграции.
Чтобы преодолеть многие из недостатков имеющихся методов, мы используем реального времени автоматизированных оптической камеры. Оптическая камера является системой обнаружения с микроскопом высокой пропускной способности в небольшой платформе с объективом, блок подсветки и цифровой фотоаппарат. Она имеет встроенный программного обеспечения, которое можно проверить, миграции и распространения среди других вещей. Чтобы обнаружить миграции, два алгоритмы используются для анализа роста и кинетика миграции клеток, которые называются распространения и ранозаживляющее анализа, соответственно. Анализ распространения основе алгоритма сегментации изображения двухэтапный, которая применяет текстуру анализ различий между районами охватывает ячейки (показано желтым цветом) и пустой фон области путем анализа передовых гистограммы. Ранозаживляющее анализ основан на три шага алгоритма, который обнаруживает монослое клеток, находит разрыва раны и определяет ширина зазора. Эти действия проводятся в моменты времени, определяемые пользователем, и данные представлены как крытой площади, ширина зазора и разрыв области. Одним из главных преимуществ этой машины является, что он позволяет изображений адэрентных клеток через жидкости из-за угла камеры21. Изображения камеры lenstakes наклонена, которые, согласно прогнозам, z стек одной плоскости z генерировать для обеспечения того, чтобы фотографии в фокусе (рис. 2). z стеки создаются путем слияния серии фотографий (например 40) перпендикулярно к краю рану и через всю рану. Z стеки позволяет захвата глубины слоя клеток, а также в фокальной плоскости через рану. Кроме того серии изображений могут быть объединены в коллекцию видео изображения, с одним нажатием кнопки.
Мы демонстрируем оптимизированный протокол для обнаружения миграции в линии клеток кератиноцитов HaCaT. Мы проверили, лактоферрин и его N-терминальный пептида, Lactoferricin, от людей и коров, чтобы анализировать их влияние на миграцию, как было продемонстрировано, что эти молекулы имеют многочисленные приложения как антимикробное и иммунной, модулирует молекулы22 , 23. четыре соединения были по сравнению с необработанными HaCaT клеток и эпидермального фактора роста (EGF) был использован в качестве позитивного элемента управления.
Protocol
Representative Results
Discussion
О важности миграции в исследованиях развития, заживление ран, иммунологии и рака привело к несколько различных методов для изучения миграции. Миграция может быть выражением расширения или закрытия разрыва клетками. Чаще всего закрытие нуля проверяется, как это легче расти клеток в мон…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Датский Совет независимых исследований, технологии и производства, Грант #4005-00029
Materials
| oCelloScope | BioSense Solution ApS | Optical camera | |
| UniExplorer software | BioSense Solution ApS | (8.0.0.7144 (RL3)) | |
| HaCaT cell | Donated from Bispebjerg Hospital | ||
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | Medium for HaCaT |
| FBS | Gibco | 10270 | Fetal bovine serum |
| PBS | Gibco | D837 | Without Mg+ and Ca2+ |
| Pencillin-Streptomycin | Sigma | P0781 | Antibiotics |
| Trypsin (10x) | Sigma | T3924 | |
| Mitomycin C | Tocris | 3258 | Inhibits proliferation |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 677 180 | |
| Incubator | Panasonic | 37°C, 5% CO2 | |
| Hemocytometer | Assistent | Türk (0.1 mm) | |
| Pipet boy | Accu-Jet pro |
References
- Frykberg, R. G., Banks, J. Challenges in the Treatment of Chronic Wounds. Advances in wound care. 4 (9), 560-582 (2015).
- da Silva, L., Carvalho, E., Cruz, M. T. Role of neuropeptides in skin inflammation and its involvement in diabetic wound healing. Expert opinion on biological therapy. 10 (10), 1427-1439 (2010).
- Vyas, K. S., Wong, L. K. Detection of Biofilm in Wounds as an Early Indicator for Risk for Tissue Infection and Wound Chronicity. Annals of Plastic Surgery. 76 (1), 127-131 (2016).
- Paul, C. D., Mistriotis, P., Konstantopoulos, K. Cancer cell motility: lessons from migration in confined spaces. Nature Reviews Cancer. 17 (2), 131-140 (2016).
- Folkman, J. Angiogenesis. Annual review of medicine. 57, 1-18 (2006).
- Monsuur, H. N., et al. Methods to study differences in cell mobility during skin wound healing in vitro. Journal of Biomechanics. 49 (8), 1381-1387 (2016).
- Tang, L., et al. Human lactoferrin stimulates skin keratinocyte function and wound re-epithelialization. The British journal of dermatology. 163 (1), 38-47 (2010).
- Ashby, W. J., Zijlstra, A. Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration. Integrative Biology. 4 (11), 1338-1350 (2012).
- Klettner, A., Tahmaz, N., Dithmer, M., Richert, E., Roider, J. Effects of aflibercept on primary RPE cells: toxicity, wound healing, uptake and phagocytosis. British Journal of Ophthalmology. 98 (10), 1448-1452 (2014).
- Doyle, W., Shide, E., Thapa, S., Chandrasekaran, V. The effects of energy beverages on cultured cells. Food and Chemical Toxicology. 50 (10), 3759-3768 (2012).
- Zordan, M. D., Mill, C. P., Riese, D. J., Leary, J. F. A high throughput, interactive imaging, bright-field wound healing assay. Cytometry Part A. 79 (3), 227-232 (2011).
- Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. Electrical wound-healing assay for cells in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (6), 1554-1559 (2004).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Räsänen, K., Vaheri, A. TGF-beta1 causes epithelial-mesenchymal transition in HaCaT derivatives, but induces expression of COX-2 and migration only in benign, not in malignant keratinocytes. Journal of Dermatological Science. 58 (2), 97-104 (2010).
- Tochio, T., Tanaka, H., Nakata, S., Hosoya, H. Fructose-1,6-bisphosphate aldolase A is involved in HaCaT cell migration by inducing lamellipodia formation. Journal of Dermatological Science. 58 (2), 123-129 (2010).
- Tomasz, M. Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective). Chemistry and Biology. 2 (9), 575-579 (1995).
- Stamm, A., Reimers, K., Strauß, S., Vogt, P., Scheper, T., Pepelanova, I. In vitro wound healing assays – state of the art. BioNanoMaterials. 17 (1-2), 79-87 (2016).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. Journal of Visualized Experiments. (88), 1-8 (2014).
- Jonkman, J. E. N., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 440-451 (2016).
- Hong, J., Kandasamy, K., Marimuthu, M., Choi, C. S., Kim, S. Electrical cell-substrate impedance sensing as a non-invasive tool for cancer cell study. The Analyst. 136 (2), 237-245 (2011).
- Fredborg, M., et al. Real-time optical antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).
- Jenssen, H. Anti herpes simplex virus activity of lactoferrin/lactoferricin – An example of antiviral activity of antimicrobial protein/peptide. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (24), 3002-3013 (2005).
- Jenssen, H., Hancock, R. E. W. Antimicrobial properties of lactoferrin. Biochimie. 91 (1), 19-29 (2009).
- Delva, E., Tucker, D. K., Kowalczyk, A. P. The desmosome. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 1 (2), 1-17 (2009).
- Ponti, A. Two Distinct Actin Networks Drive the Protrusion of Migrating Cells. Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).
- Canali, C., Spillum, E., Valvik, M., Agersnap, N., Olesen, T. . Whitepaper a Digital Time-Lapse Bright Field Technology To Drive Faster, Higher Throughput Bioanalysis. , (2016).
- Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration. Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).
- Ilina, O., Friedl, P. Mechanisms of collective cell migration at a glance. Journal of Cell Science. 122 (18), 3203-3208 (2009).
