用自动光学相机进行细胞迁移的体外试验优化划痕试验
Summary
在这里, 我们描述了一个程序, 以测试的细胞迁移体外与自动光学相机显微镜。刮伤试验已被广泛使用, 在结束后的划痕是一个设定的周期。光学显微镜能够可靠、廉价地检测细胞的迁移。
Abstract
细胞迁移是一个重要的过程, 影响健康的许多方面, 如伤口愈合和癌症, 因此, 这是至关重要的发展方法, 研究的迁移。由于其成本低、操作简单, 在体外检测化合物的抗性和亲迁移性方面一直是最常用的方法。然而, 一个经常报告的问题的检测是积累的细胞跨越边缘的划痕。此外, 为了从化验中获取数据, 不同曝光的图像必须在同一地点拍摄一段时间, 以比较迁移的运动。不同的分析程序可以用来描述的划痕闭合, 但他们是劳动密集型, 不准确, 和力量循环的温度变化。在这项研究中, 我们展示了一个优化的方法来测试的迁移效果,如自然发生的蛋白质人-和牛乳铁蛋白及其 n-末端肽乳铁素在上皮细胞系 HaCaT。一个关键的优化是清洗和刮在 PBS, 这消除了前面的细胞积累沿边缘。这可以通过去除阳离子来解释, 这已经被证明对角质形成细胞的连接有影响。为确保对迁移的真实检测, 在该协议中加入了丝裂霉素 C (DNA 合成抑制剂) 的预处理。最后, 我们演示了自动光学相机, 它消除了过度的温度循环, 手工劳动与划痕分析, 同时提高重现性和确保分析的相同部分的划痕随着时间的推移。
Introduction
迁移是影响几个生理方面的重要过程。在伤口愈合中, 迁移有利于皮肤的重新上皮化。在非愈合伤口, 如慢性伤口, 机会性细菌引起的伤口感染, 开放性伤口是理想的细菌生长和形成生物膜1,2。生物膜是耐药性细菌发展的主要原因之一, 是我国现代社会面临的最大威胁之一3。在伤口愈合过程中, 免疫细胞无法穿透生物膜。在癌症中, 癌细胞的迁移是转移的关键步骤, 这是4、5实体肿瘤患者死亡的主要原因。因此, 能够研究迁移是至关重要的。
擦伤检测通常用于测试细胞迁移, 因为它便宜, 易于执行黏附细胞线, 如成纤维细胞, 内皮, 和上皮细胞线6,7。今天, 有几个方法来执行划痕8, 并报告了不同的材料, 包括牙签9, 电池铲运机10, 激光11, 电流12。所有的方法都有不同的优缺点, 应该根据单元类型、预算和分析工具来确定方法。举例来说, 如果使用的细胞类型需要涂层, 手动减压,如牙签或吸管提示, 将影响在该地区的迁移, 应使用不同的方法。在本研究中, 我们将专注于手工刮擦。
手工刮擦的缺点是大小、划痕的形状和划痕边缘的单元格堆积的变化。许多协议存在, 并且一张高度被引述的纸劝告增加的速度和/或者彻底洗涤在划伤13以后。此外, 还使用了几种方法来最大限度地减少扩散, 因为细胞的增殖不能与移徙区分开来, 因此可能给移徙带来假阳性结果。一些报告的方法是血清饥饿前的14和减少的数量的血清15。然而, 这两种方法都不能确保没有扩散。因此, 我们报告一个前处理细胞丝裂霉素 C, 以确保真正的迁移结果。丝裂霉素 C 是一种抗生素, 它通过与 dna 形成共价键来抑制 dna 合成, 从而防止 dna 分离16。通过对丝裂霉素 C 的预处理, 在刮伤前用 PBS 洗涤, 检测到的间隙闭合显示了细胞的真正迁移 (图 1)。
所有方法的一个特点是需要一个系统来分析迁移17的过程。一个常见的和廉价的方法来分析的进展是使用光场显微镜拍摄的图像的划痕在预先确定的时间点, 然后分析关闭的差距在图像软件18,19。这种方法是费时的, 不可靠的关于拍照在同一地点和焦点, 和运动从孵化器到相机的力量周期的温度变化, 而拍摄。还开发了其他方法, 通过测量电流流量来检测偏移量。目前的变化, 因为细胞覆盖更多的空间在板块上, 这是读取作为增加阻抗20。通过测量阻抗, 细胞的环境不受影响, 因此该方法被认为是无侵入性的。这种方法依赖于专门的板, 金电极, 这是昂贵的, 但它们能够检测到许多过程, 如细胞黏附, 增殖, 迁移和细胞死亡。这种方法的一个很大的缺点是阻抗测量不能直接表示迁移, 因为温度等因素对阻抗有很大的影响。阻抗的变化可能是由软件没有审查的几个因素引起的, 使得对数据的分析更加困难。因此, 缺乏可视化需要常规的光显微镜来验证迁移。
为了克服现有技术的许多缺点, 我们使用实时自动光学相机。光学摄像头是一种检测系统, 具有高吞吐量的显微镜, 在一个小的平台上有透镜, 照明单元, 和数码相机。它有一个内置的软件, 它可以测试迁移和扩散等其他事情。为了检测迁移, 分别用两种算法对细胞的生长和迁移动力学进行了分析, 称为增殖和创面愈合分析。扩散分析是基于两步图像分割算法, 应用纹理分析方法, 通过高级直方图分析来检测细胞覆盖区域 (黄色) 和空背景区域之间的差异。伤口愈合分析是基于三步算法检测细胞单层, 定位伤口间隙, 确定间隙宽度。这些步骤是在用户确定的时间点进行的, 数据显示为覆盖区域、间隙宽度和间隙区域。这台机器的最大优点之一是, 它能够通过液体, 因为相机21的角度来成像粘附细胞。相机 lenstakes 倾斜的图像, 投影到 z 栈的单 z 平面生成, 以确保图片的焦点 (图 2)。z 栈是通过合并的一系列图片 (如40) 垂直于伤口边缘, 并贯穿整个伤口生成。z 栈能够捕捉到细胞层的深度, 以及贯穿伤口的聚焦平面。此外, 该系列图像可以放在一起的图像视频收集, 点击一个按钮。
我们演示了一个优化的协议, 以检测角质形成细胞线 HaCaT 的迁移。我们测试了乳铁蛋白及其 n-端肽, 乳铁素, 从人类和奶牛, 分析其对迁移的影响, 因为这些分子已经证明有许多应用作为抗菌和免疫调节分子22,23. 将四种化合物与未经处理的 HaCaT 细胞进行比较, 并将表皮生长因子 (EGF) 用作阳性对照。
Protocol
Representative Results
Discussion
移徙在发展、创伤愈合、免疫学和癌症研究中的重要性导致了研究迁移的几种不同方法。迁移可以是由单元格扩展或关闭间隙的表达式。最常见的抓痕的闭合是测试, 因为它是更容易种植细胞在单层, 然后做一个擦伤比生长的细胞在特定的形式8。我们的研究表明, 手工抓伤的优化方法, 因为该技术是易于掌握和低成本。我们介绍了 DNA 合成抑制剂丝裂霉素 C, 一个额外的清洗, 以优?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
丹麦独立研究、技术和生产理事会, 赠款 #4005-00029
Materials
| oCelloScope | BioSense Solution ApS | Optical camera | |
| UniExplorer software | BioSense Solution ApS | (8.0.0.7144 (RL3)) | |
| HaCaT cell | Donated from Bispebjerg Hospital | ||
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | Medium for HaCaT |
| FBS | Gibco | 10270 | Fetal bovine serum |
| PBS | Gibco | D837 | Without Mg+ and Ca2+ |
| Pencillin-Streptomycin | Sigma | P0781 | Antibiotics |
| Trypsin (10x) | Sigma | T3924 | |
| Mitomycin C | Tocris | 3258 | Inhibits proliferation |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 677 180 | |
| Incubator | Panasonic | 37°C, 5% CO2 | |
| Hemocytometer | Assistent | Türk (0.1 mm) | |
| Pipet boy | Accu-Jet pro |
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