Optimeret Scratch Assay for In Vitro test af celle Migration med en automatiseret optisk kamera

Summary

Her beskriver vi en metode til at teste celle migration i vitro med en automatiseret optisk kamera mikroskop. Scratch analysen har været meget udbredt, hvor lukningen af bunden er fulgt for en nærmere fastsat periode. Optisk mikroskop giver mulighed for pålidelige og billige påvisning af celle migration.

Abstract

Celle migration er en vigtig proces, der påvirker mange aspekter af sundhed, såsom sårheling og kræft, og det er derfor afgørende for at udvikle metoder til undersøgelse af migration. Scratch analysen har længe været den mest almindelige in vitro- metode til at teste stoffer med anti og pro migration egenskaber på grund af sin lave omkostninger og enkel procedure. En ofte rapporteret problemet med analysen er imidlertid ophobning af celler i hele kanten af bunden. Desuden, for at hente data fra analysen, billeder af forskellige engagementer skal tages over en periode på præcis samme sted at sammenligne bevægelser af migration. Forskellige analyse programmer kan bruges til at beskrive de scratch lukning, men de er arbejdskrævende, unøjagtige, og styrker cyklusser af temperaturændringer. I denne undersøgelse viser vi en optimeret metode til afprøvning migration virkning, fx med de naturligt forekommende proteiner menneskelige – og kvæg-Lactoferrin og deres N-terminale peptid Lactoferricin på linjen epitelcelle HaCaT. En afgørende optimering er at vaske og ridse i PBS, som eliminerer den førnævnte ophobning af celler langs kanten. Dette kan forklares ved fjernelse af kationer, som har vist sig at have en effekt på keratinocytter celle-celle forbindelse. For at sikre korrekt registrering af migration, blev før behandling med mitomycin C, en DNA syntese hæmmer, tilføjet til protokollen. Endelig, vi vise automatiseret optisk kameraet, hvilket eliminerer uforholdsmæssigt store temperatur cyklusser, manuel arbejdskraft med scratch lukning analyse, samtidig med at forbedre på reproducerbarhed og sikre analyse af identiske dele af scratch over tid.

Introduction

Migration er en vigtig proces, der påvirker flere fysiologiske aspekter. I sårheling letter migration re epithelization af huden. I ikke-healing sår, såsom kroniske sår, opportunistiske bakterier forårsager infektion i såret, og åbne sår er ideelle til bakterievækst og dannelse af biofilm^1,2. Biofilm er en af årsagerne til udviklingen af resistente bakterier, som er en af de største trusler mod vores moderne samfund³. I sårheling, immunceller ikke kan trænge igennem biofilm. I kræft er migration af kræftceller et afgørende skridt på metastaser, som er den primære dødsårsag for patienter med solide tumorer^4,5. Derfor er det afgørende at kunne studere migration.

Scratch analysen er ofte bruges til at teste celle migration, fordi det er billigt og let at udføre på vedhængende cellelinjer, såsom fibroblast, endotel, og epitelcelle linjer^6,7. I dag findes flere metoder til at udføre ridser⁸, og forskellige materialer er blevet rapporteret til at blive brugt, herunder tandstikkere⁹, celle skrabere¹⁰, lasere¹¹og elektrisk strøm¹². Alle metoderne har forskellige fordele og ulemper, og metoden bør besluttes efter celle type, budget og analyse værktøj. Som et eksempel, hvis den anvendte celletype kræver belægning, manuel pres fjernelse, fx med en tandstikker eller pipette tip, vil påvirke migration inden for området, en anden metode bør anvendes. I denne undersøgelse, vil vi fokusere på manuel afskrabning.

En ulempe for manuel afskrabning er variation af størrelsen, former for ridser og ophobning af celle på kanten af bunden. Mange protokoller findes, og en meget citeret papir rådgiver øget hastighed og/eller grundig vask efter skrabe¹³. Derudover er flere metoder blevet brugt til at minimere spredning, da spredning af cellerne ikke kan skelnes fra migration og derfor kan give falsk-positive resultater af migration. Nogle rapporterede metoder serum sult forud for de scratch¹⁴ og mindske mængden af serum¹⁵. Ingen af disse metoder kan dog sikre, at der er ingen spredning. Derfor kan vi rapportere en forbehandling af celler med mitomycin C at sikre ægte resultater af migration. Mitomycin C er et antibiotikum, der hæmmer DNA-syntese ved at danne et kovalente bånd med DNA, som forhindrer DNA fra adskille¹⁶. Før behandling med mitomycin C og vask med PBS før ridser, viser fundne lukning af hullet den sande migration af celler (figur 1).

Karakteristisk for alle metoderne, der er behov for et system til at analysere processen med migration¹⁷. En fælles og en billig metode til at analysere fremskridt, der er at bruge en lys-felt mikroskop til at tage billeder af bunden på forud fastsatte tidspunkter, efterfulgt af en analyse af lukning af hullet i et billede software^18,19. Denne metode er tidskrævende, upålidelige med hensyn til at tage billeder på samme sted og fokus, og bevægelsen fra inkubator til kamera styrker cyklusser af temperaturændringer, mens billeder er taget. Andre metoder er blevet udviklet til at opdage migration ved at måle den aktuelle flow. De aktuelle ændringer, som cellerne dække mere plads på den plade, som er læst som en forøgelse af impedans²⁰. Ved at måle impedans, miljø i cellerne påvirkes ikke, og metoden er derfor anses for ikke-invasiv. Denne metode bygger på specialiserede plader med guld elektroder, som er dyre, men de muliggøre påvisning af mange processer, såsom overholdelse af cellulære, spredning, migration og celledød. En stor ulempe ved denne metode er, at impedans måling ikke direkte angive migration, som faktorer, såsom temperatur har en stor indvirkning på impedans. Ændringer i impedans kan være forårsaget af flere faktorer, der ikke er gennemgået af den software, gør analysen af data mere vanskeligt. Derfor kræver manglen på visualisering en konventionel lysmikroskop at kontrollere migrering.

For at overvinde mange af ulemperne af de tilgængelige teknikker, bruger vi en real-time automatiseret optisk kamera. Den optiske kamera er en detection system med en høj overførselshastighed mikroskop i en lille platform med en linse, belysning enhed og et digitalt kamera. Det har en indbygget software, som kan teste overførsel og spredning blandt andre ting. For at påvise en migration, bruges to algoritmer til at analysere væksten og migration kinetik af celler, der kaldes spredningen og den sårheling analyse, henholdsvis. Spredning analyse er baseret på en to-trins image segmentering algoritme, der anvender tekstur analyse for at registrere forskellen mellem celle-dækkede områder (vist med gult) og tom baggrund områder af avancerede histogram analyse. Sårheling analyse er baseret på en tre-trins algoritme, der registrerer den celle éncellelag, lokaliserer sår hul og bestemmer mellemrumsbredden. Disse trin er gennemført på bruger-bestemt tidspunkt-point, og data præsenteres som overdækket areal, Mellemrumsbredde og gap område. En af de store fordele ved denne maskine er, at det muliggør billeddannelse af vedhængende celler gennem væske på grund af vinklen af kamera²¹. Lenstakes skrå kamerabilleder, der er fremskrevet til en z-stak en enkelt z-fly generere for at sikre, at billederne er i-fokus (figur 2). z-stakke genereres ved at flette serien af billeder (f.eks. 40) taget vinkelret på såret kanten og på tværs af hele såret. Z-stakke kan indfange af dybden af cellelag samt en i-fokus flyet på tværs af såret. Desuden, serien af billeder kan sættes sammen til en video samling af billeder, med et klik på en knap.

Vi demonstrere en optimeret protokol til påvisning af migration i linjen keratinocytter celle HaCaT. Vi testede Lactoferrin og dens N-terminale peptid, Lactoferricin, fra mennesker og køer, til at analysere deres effekt på migration som disse molekyler er blevet påvist for at have mange programmer som antimikrobielle og immun modulerende molekyler^{22 , 23}. de fire forbindelser blev sammenlignet med ubehandlet HaCaT celler og epidermal vækstfaktor (EGF) blev anvendt som positiv kontrol.

Protocol

Opsætningen af eksperimenterende har ingen etiske og juridiske restriktioner og blev gennemført i samarbejde med Roskilde Universitet. Overblik over den eksperimentelle set-up kan ses i figur 1 og mekanismerne i den optisk kamera i figur 2. 1. forberedelse Udføre alle trinene i en steril laminar flow-bænk ved rengøring af bænken og alle udstyr med 70% ethanol forud for starten af forsøget. Placer den optisk …

Representative Results

HaCaT er en keratinocytter cellelinie, en af de mest udbredte celletyper i huden. Når et sår opstår, begynde hudceller at formere sig og vandrer såret seng at lukke såret (figur 3). Begge processer er derfor af største vigtighed for korrekt healing. Den optiske kamera kan følge begge processer i realtid. For migration, systemet giver tre datasæt: cellen dækket område, Mellemrumsbredde og g…

Discussion

Betydningen af migration i undersøgelser af udvikling, sårheling, immunologi og kræft har ført til flere forskellige metoder til at studere migration. Migration kan enten være et udtryk for en udvidelse eller lukning af kløften af celler. Oftest lukning af bunden er testet, da det er lettere at dyrke celler i en éncellelag og derefter gøre en skramme end voksende celler i en bestemt form⁸. Vores undersøgelse viser en optimeret metode til manuel ridser, som teknikken er nem at mestre og la…

Materials

oCelloScope	BioSense Solution ApS		Optical camera
UniExplorer software	BioSense Solution ApS		(8.0.0.7144 (RL3))
HaCaT cell			Donated from Bispebjerg Hospital
DMEM (1x) + GlutaMAX	Gibco	31966-021	Medium for HaCaT
FBS	Gibco	10270	Fetal bovine serum
PBS	Gibco	D837	Without Mg+ and Ca2+
Pencillin-Streptomycin	Sigma	P0781	Antibiotics
Trypsin (10x)	Sigma	T3924
Mitomycin C	Tocris	3258	Inhibits proliferation
Microtiter plate	Greiner Bio-one	677 180
Incubator	Panasonic		37°C, 5% CO2
Hemocytometer	Assistent		Türk (0.1 mm)
Pipet boy	Accu-Jet pro