Optimalisert Scratch analysen for In Vitro Testing av celle migrasjon med et automatisert optisk kamera

Summary

Her beskriver vi en prosedyre for å teste den celle migrasjon i vitro med en automatisert optiske kameraer mikroskop. Scratch analysen har vært mye brukt der nedleggelsen av scratch etterfølges for en angitt periode. Optisk mikroskopet kan pålitelig og billig påvisning av celle migrasjon.

Abstract

Celle migrasjon er en viktig prosess som påvirker mange aspekter av helse, for eksempel sårheling og kreft, og det er derfor avgjørende for å utvikle metoder for å studere overføringen. Scratch analysen har lenge vært den vanligste i vitro metoden å teste forbindelser med anti – og pro – migration egenskaper på grunn av sin lave kostnader og enkel prosedyre. En ofte rapporterte problemet med analysen er imidlertid akkumulering av celler over kanten av scratch. Videre, for å hente data fra analysen, bilder med forskjellige eksponeringer må tas over en periode på nøyaktig samme sted å sammenligne bevegelser av overføringen. Analyse programmer kan brukes til å beskrive scratch nedleggelse, men de er arbeidskrevende, unøyaktig, og styrker sykluser av temperaturendringer. I denne studien viser vi en optimalisert metode for overføring effekten, f.eks med naturlig forekommende proteiner menneske – og storfe-Laktoferrin og deres N-terminal peptid Lactoferricin på tarmepitelet linjen HaCaT. En avgjørende optimalisering er å vaske og riper i PBS, som fjerner nevnte akkumulering av celler langs kanten. Dette kan forklares ved fjerning av kasjoner, som har vist seg å ha en effekt på keratinocyte celle-celle tilkobling. For å sikre virkelig oppdagelse av migrasjon, ble pre behandle med mitomycin C, en DNA syntese hemmer, lagt til protokollen. Til slutt, viser vi automatisk optisk kameraet eliminerer høy temperatur sykluser, manuell arbeidskraft med scratch nedleggelse analyse, mens forbedre reproduserbarhet og sikre analyse av identiske scratch over tid.

Introduction

Migrasjon er en viktig prosess som påvirker flere fysiologiske aspekter. I sårheling forenkler overføring re epithelization av huden. I ikke-healing sår, som kronisk sår, opportunistiske bakterier forårsaker infeksjon av såret og åpne sår er ideelle for bakterievekst og dannelse av biofilm^1,2. Biofilm er en av årsakene til utviklingen av resistente bakterier, som er en av de største truslene mot våre samfunn³. I sårheling, immunceller ikke kan trenge gjennom biofilm. I Krepsen er migrering av kreftceller et avgjørende skritt i metastasering, som er den primære dødsårsaken for pasienter med solide svulster^4,5. Derfor er det viktig å kunne studere migrasjon.

Scratch analysen er ofte brukt til å teste celle migrasjon fordi det er billig og lett å utføre på tilhenger cellelinjer, som fibroblast, endothelial, og tarmepitelet linjer^6,7. I dag, flere metoder finnes for å utføre riper⁸, og forskjellige materialer har blitt rapportert som skal brukes, inkludert tannpirkere⁹, celle skrapere¹⁰, lasere¹¹og elektrisk strøm¹². Alle metodene har forskjellige fordeler og ulemper, og metoden bør avgjøres på ifølge celle type, budsjett og analyse verktøyet. Som et eksempel, hvis de brukte cellen krever belegg, manuell trykk fjerning, f.eks med en tannpirker eller pipette tips, vil påvirke Flyttinger innenfor området, en annen metode som skal brukes. I denne studien vil vi fokusere på manuell skraping.

En ulempe for manuell skraping er variasjonen av størrelse, former av riper og akkumulering av cellen på kantene av scratch. Mange protokoller finnes, og en svært sitert papir råder økt hastighet og/eller grundig vask etter skrape¹³. I tillegg har flere metoder blitt brukt å minimere spredning, siden spredning av cellene ikke kan skilles fra migrasjon og derfor kan gi falske positive resultater av migrasjon. Noen rapportert metoder er serum sult foran den scratch¹⁴ og redusere mengden av serum¹⁵. Men kan ingen av disse metodene sørge for at det er ingen spredning. Derfor rapportere vi en behandling av celler med mitomycin C å sikre sant resultater av migrasjon. Mitomycin C er et antibiotikum som hemmer DNA-syntese ved å danne en kovalent binding med DNA, som hindrer at DNA skille¹⁶. Pre behandle med mitomycin C og vask med PBS før skrape, demonstrerer oppdaget nedleggelsen av gapet ekte migrering av cellene (figur 1).

Karakteristisk for alle metodene er behovet for et system for å analysere prosessen med overføring¹⁷. En felles og en rimelig metode for å analysere fremdriften er å bruke en lys-feltet mikroskop for å ta bilder av scratch på forhåndsbestemt tid poeng, etterfulgt av en analyse av nedleggelsen av gapet i et bilde programvare^18,19. Denne metoden er tidkrevende, upålitelig med hensyn å ta bilder på samme sted og fokus, og bevegelsen fra inkubator til kameraet styrker sykluser av temperaturendringer mens bildene er tatt. Andre metoder har blitt utviklet for å oppdage migrasjon ved å måle gjeldende flyt. Gjeldende endringer, som cellene dekker mer plass på platen, som leses som en økning i impedans²⁰. Måle impedans, innvirkning på miljøet i cellene og metoden er derfor betraktes ikke-invasiv. Denne metoden er avhengig av spesialiserte plater med gull elektrodene, som er dyrt, men de gjør det mulig påvisning av mange prosesser, som cellular etterlevelse, spredning, migrasjon og celledød. En stor ulempen med denne metoden er at impedans målingen ikke indikerer direkte overføring som faktorer som temperatur har en stor innvirkning på impedansen. Endringer i impedansen kan være forårsaket av faktorer som ikke er gjennomgått av programvaren, gjør analyse av dataene vanskeligere. Derfor, mangelen på visualisering krever konvensjonelle lys mikroskop bekrefte overføringen.

For å overvinne mange av downsides av tilgjengelige teknikker, bruker vi en sanntid automatisert optiske kameraer. Optisk kameraet er en detection system med høy gjennomstrømming mikroskop på en liten plattform med en objektiv, belysning enhet og et digitalt kamera. Den har en innebygd programvare, hvilke kanne test migrasjon og spredning blant annet. For å oppdage migrasjon, brukes to algoritmer å analysere veksten og migrasjon kinetics av celler som kalles spredning og såret healing analyse, henholdsvis. Spredning analyse er basert på en to-trinns bilde segmentering algoritme som gjelder tekstur analyse for å oppdage forskjellen mellom cellen dekket områder (vist i gult) og Tom bakgrunn områder av avanserte histogrammet analyse. Såret healing analyse er basert på en tre-trinns algoritme som oppdager celle monolayer, finner såret gapet, og bestemmer mellomromsbredden. Disse trinnene utføres på bruker-bestemt tidspunkt, og dataene er presentert som dekket området og mellomromsbredden gapet området. En av de store fordelene med denne maskinen er at den lar imaging tilhenger celler gjennom væske på grunn av vinkelen på kameraet²¹. Lenstakes vippet kamerabildene som er anslått til en z-stabel med et enkelt z-fly generere for å sikre at bildene i fokus (figur 2). z-stabler genereres ved å flette en rekke bilder (f.eks 40) tatt vinkelrett til såret kanten, og over hele såret. Z-stabler kan fange av dybden av cellen laget som en i fokus fly over såret. Videre, en rekke bilder kan settes sammen til en video samling av bilder, ved å klikke på en knapp.

Vi viser en optimalisert protokoll for gjenkjenning for keratinocyte celle linjen HaCaT. Vi testet Laktoferrin og dens N-terminal peptid, Lactoferricin, fra mennesker og kyr, å analysere sin effekt på overføring som disse molekylene er påvist for å ha mange programmer som antimikrobielle og immun modulerende molekyler^{22 , 23}. de fire forbindelsene ble sammenlignet med ubehandlet HaCaT celler og epidermal vekstfaktor (EGF) ble brukt som en positiv.

Protocol

Eksperimentell oppsettet har ingen etiske og juridiske restriksjoner og ble gjennomført med Roskilde University. En oversikt over den eksperimentelle set-up ses i figur 1 og mekanismer for optisk kameraet i figur 2. 1. forberedelse Utføre alle skritt i et sterilt laminær strømning-benk av benken og alt utstyr med 70% etanol før starten av eksperimentet. Plassere optisk kameraet i en konvensjonell inkubator på…

Representative Results

HaCaT er en keratinocyte cellen linje, en av de rikeste celletyper i huden. Når et sår oppstår, begynner hudceller å spre seg og migrere over til såret sengen å lukke såret (Figur 3). Begge prosessene er derfor av største betydning for riktig helbredelse. Optisk kameraet kan følge begge prosessene i sanntid. For overføring systemet gir tre datasett: cellen dekket området og mellomromsbred…

Discussion

Betydningen av migrasjon i studier av utvikling, sårheling, immunologi og kreft har ført til flere forskjellige metoder å studere migrasjon. Migrasjon kan være et uttrykk for utvidelse eller nedleggelsen av gapet av cellene. Oftest nedleggelsen av scratch er testet, som det er lettere å vokse celler i en monolayer og deretter lage en ripe enn stadig cellene i et bestemt skjema⁸. Vår studie viser en optimalisert metode for manuell avlysning, teknikken er lett å mestre og lav pris. Vi introdu…

Materials

oCelloScope	BioSense Solution ApS		Optical camera
UniExplorer software	BioSense Solution ApS		(8.0.0.7144 (RL3))
HaCaT cell			Donated from Bispebjerg Hospital
DMEM (1x) + GlutaMAX	Gibco	31966-021	Medium for HaCaT
FBS	Gibco	10270	Fetal bovine serum
PBS	Gibco	D837	Without Mg+ and Ca2+
Pencillin-Streptomycin	Sigma	P0781	Antibiotics
Trypsin (10x)	Sigma	T3924
Mitomycin C	Tocris	3258	Inhibits proliferation
Microtiter plate	Greiner Bio-one	677 180
Incubator	Panasonic		37°C, 5% CO2
Hemocytometer	Assistent		Türk (0.1 mm)
Pipet boy	Accu-Jet pro