Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection

Hye-Young Lee; So Eui Lee; Jongchan Woo; Doil Choi; Eunsook Park

doi:10.3791/57719

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Biology

Split-grün fluoreszierendes Protein System Effektoren geliefert von Bakterien während der Infektion zu visualisieren

Published: May 24, 2018

doi:

10.3791/57719

Hye-Young Lee, So Eui Lee, Jongchan Woo, Doil Choi, Eunsook Park

¹Department of Plant Science, Plant Genomics and Breeding Institute, College of Agriculture and Life Science,Seoul National University, ²Department of Bioindustry and Bioresource Engineering,Sejong University

Summary

Fluoreszierende Protein-basierte Ansätze, Effektoren abgesondert von Bakterien in Wirtszellen zu überwachen sind anspruchsvoll. Dies ist aufgrund der Inkompatibilität zwischen fluoreszierende Proteine und die Typ-III-Sekretion-System. Hier wird eine optimierte Split Superfolder GLP-System zur Visualisierung von Effektoren abgesondert von Bakterien in die Wirtszelle Pflanze verwendet.

Abstract

Bakterien, eines der wichtigsten Erreger von verschiedenen Pflanzenkrankheiten, absondern, eine Reihe von Effektor-Proteine in die Wirtszelle Pflanze, die Pflanze Immunsystem zu untergraben. Während der Infektion werden zytoplasmatischen Effektoren Host Zytosol über einen Typ III-Sekretion System (T3SS) geliefert. Nach der Anlieferung in die Pflanzenzelle zielt auf die Effector(s) der spezifischen Kompartiments um Zelle Hostprozesse für Überleben und Replikation des Erregers zu modulieren. Zwar gab es einige der Forschung auf die subzelluläre Lokalisation der Effektor-Proteine in den Wirtszellen, ihre Funktion in der Pathogenität zu verstehen, durch die Verwendung von fluoreszierenden Proteinen, Untersuchung der Dynamik von Effektoren direkt aus Bakterien injiziert ist aufgrund der Inkompatibilität zwischen der T3SS und fluoreszierende Proteine eine Herausforderung gewesen.

Hier beschreiben wir unsere jüngsten Methode eines optimierten Split Superfolder grün fluoreszierendes Protein Systems (SfGFP^OPT), die Lokalisierung von Effektoren geliefert über die bakterielle T3SS in der Wirtszelle zu visualisieren. Die sfGFP11 (11^th β-Aktionsbereich des SfGFP)-tagged Effektor abgesondert durch die T3SS kann mit einem bestimmten Organell, die gezielte sfGFP1-10^OPT (1-10^th β-Aktionsbereich des SfGFP) führenden zur Fluoreszenzemission am Standort montiert werden. Dieses Protokoll enthält eine Prozedur zum rekonstituierten SfGFP Fluoreszenzsignal mit einem Effektor-Protein von Pseudomonas Syringae in einem bestimmten Organell in Arabidopsis und Nicotiana Benthamiana Pflanzen zu visualisieren.

Introduction

Pflanzen sind festsitzende Organismen, die zahlreiche eindringende Krankheitserreger wie Bakterien, Pilze, Viren, Insekten und Nematoden während ihres gesamten Lebenszyklus zu begegnen. Unter den phytopathogene Gramnegative bakterielle Krankheitserreger wie Pseudomonas spp. und Ralstonia spp., infizieren ihre Wirtspflanzen durch Eingabe durch Wunden oder natürliche Öffnungen, z. B. die Spaltöffnungen und Hydathode¹. Um erfolgreich Wirtspflanzen besiedeln, haben bakterielle Krankheitserreger entwickelt, um eine Vielzahl von Virulenz Faktoren²entwickeln. Wenn Bakterien eine Wirtspflanze eindringen, sie injizieren eine Reihe von Virulenz Proteinen – bekannt als Effektoren – direkt in die Pflanzenzellen ihre Pathogenität zu fördern. Diese Effektoren unterdrücken oder modulieren die Pflanze angeborene Immunität und zelluläre Hostprozesse um bakterielle überleben³führen zu manipulieren.

Pathogene Bakterien verwenden hauptsächlich eine T3SS Effektor-Proteine direkt in Host Zellen⁴liefern. Das T3SS ähnelt eine molekularen Spritze mit einem nadelartigen Kanal Anschluss von einem Gerüst-Protein-Struktur über die innere und die äußere bakterielle Membranen an der Injektionsstelle des Host Zelle⁵. Dieser T3SS-vermittelte Effektor (T3E) Sekretion Mechanismus ist gut erhaltenen in verschiedenen Gramnegative bakterielle Erreger der Anlage als auch menschliche. Eines der repräsentativen Pflanzenpathogene, p. Syringae pv. Tomaten DC3000 HrcC Mutant hat in der Regel eine defekte T3SS beschränkt hat Wachstum bei Pflanzen wahrscheinlich aufgrund der Unfähigkeit dieser Mutante, die Pflanze Immunität (durch die Injektion von Effektor-Proteine)⁶vollständig zu unterdrücken. Bei der Translokation in den Wirtszellen Ziel Effektoren verschiedene Host-Proteine, die wichtig für das Hostsystem Zelle, einschließlich Anlage Verteidigung Antworten, Gentranskription Zelltod, Proteasom, Vesikel Menschenhandel und Hormon Wege⁷ ^, ⁸ ^, ⁹ ^, ¹⁰. Verfolgung von der zellulären Lokalisation der Effektor-Proteine in den Wirtszellen deshalb ein attraktives Ziel, ihre Funktionen in Bezug auf die Modulation der Pflanze Immunität zu verstehen.

Die meisten Studien, Lokalisierung von den T3Es haben Agrobakterium –vermittelten Überexpression mit einem großen Fluoreszenz-Protein in der Host-Anlage⁹beschäftigt. Jedoch die heterologen Expression-Methode nach Genen, die bei anderen Spezies eingeführt werden nachweislich falsch lokalisierten oder gelegentlich nicht-funktionale¹¹^,¹²^,¹³Jahre alt sein. Darüber hinaus ergab mehrere Studien, dass bakterielle Effektoren Modifikation für eine korrekte Ausrichtung in den Host Zellen¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷unterziehen. Daher äußerte vorübergehend Effektoren in das Zytosol der Anlage können Zellen nicht quantitativ oder funktional identisch mit den Effektoren, die durch die T3SS auf Erreger Infektion¹⁸geliefert werden. Darüber hinaus kann die Fusion von großen fluoreszierende Tags Effektorproteine richtige Effektor Lieferung und Visualisierung¹⁸^,¹⁹stören. Daher können diese Ansätze für die T3E Funktion assay nicht voll die native Lokalisierung des T3SS abgesondert Effektoren widerspiegeln.

Ein grünes fluoreszierendes Protein (GFP) besteht aus einer 11-Stranded β-Fass umschließt ein Leitbündel, die ein Chromophor²⁰enthält. Waldo Et al. berichtet eine neuartige Split-GFP-System, das eine kleine Komponente besteht (GFP β Aktionsbereich 11; GFP11) und ein großes ergänzende Fragment (GFP β Strang 1-10; GFP1-10)²¹. Die Fragmente nicht fluoreszieren selbst aber auf ihre selbstassoziation fluoreszieren, wenn beide Fragmente in der Nähe miteinander sind. Für die Optimierung der Protein Falten Effizienz wurden robuste faltbare Varianten der GFP, d. h., SfGFP und SfGFP^OPT, anschließend für die Split GFP System²⁰^,²¹^,²²entwickelt. Vor kurzem, einzelne Aminosäure mutierte Varianten des sfGFP1-10^OPT– sfYFP1-10^OPT und sfCFP1-10^OPT-, die mit sfGFP11 Fragment und Show gelb und Cyan Fluoreszenz bzw. rekonstruieren können, waren generierten²³. Darüber hinaus SfCherry, ein Derivat des mCherry, kann aufgeteilt werden in sfCherry1-10 und sfCherry11 Fragmente in der gleichen Weise wie SfGFP²³.

Dieses System wurde angepasst zu kennzeichnen und verfolgen die T3SS Effektoren in HeLa-Zellen während der Infektion mit den Effektoren von Salmonellen²⁴. Jedoch war es bisher nicht für das Hostsystem Pflanze-bakterielle Erreger optimiert. Vor kurzem haben wir optimiert Split GFP-System basierend auf die verbesserte sfGFP1-10^OPT , die subzelluläre Lokalisation der T3Es von p. Syringae in pflanzlichen Zellen²⁵geliefert zu überwachen. Zur Erleichterung der Lokalisierungs-Arbeiten des T3Es zu verschiedenen subzelluläre Kompartimente in den Pflanzenzellen, eine Reihe von transgenen Arabidopsis Thaliana wurden Pflanzen erzeugt, um sfGFP1-10^OPT in die verschiedenen subzelluläre Kompartimente^{express 25}. Darüber hinaus Plasmide tragen eine Vielzahl von Organell-sfGFP1-10^OPT für gezielt Agrobakterium-vermittelten transiente Überexpression und die sfGFP11-Tags Vektoren für die Lieferung des T3SS-basierte Effektor auch erzeugt wurden. Die Samen der verschiedenen transgenen Arabidopsis -Linien und die Plasmide, die T3Es von Interesse auszudrücken erhalten Sie bei Quellen, die in der Tabelle der Materialien²⁶^,²⁷erwähnt.

In das folgende Protokoll beschreiben wir ein optimales System zur Überwachung der Dynamik von Effektoren von Bakterien in den Wirtszellen mit Split-SfGFP-System geliefert. Infektion von Pflanzen, sfGFP1-10^OPT mit transgenen Pseudomonas tragen rekombinante sfGFP11 Plasmid führt zu einer Lieferung von der sfGFP11-Tags Effektor von Pseudomonas in der Wirtszelle. Infolgedessen diese Proteine sind wieder hergestellt und zu bestimmten Effektor Ziel Kompartiments translozieren. Pseudomonas Syringae pv. Tomaten Verwendet wurde CUCPB5500-Stamm, die in dem 18 Effektoren gelöscht werden, weil diese Sorte niedrige oder keine Zelltod in A. Thaliana und N. Benthamianas²⁸zeigte. Jedoch können alle Materialien und hier beschriebenen Schritten ersetzt oder geändert, um Split-SfGFP-System zur Untersuchung von anderen biologischen Fragen oder Optimierung unter bestimmten Laborbedingungen anzupassen.

Protocol

Hinweis: Alle Schritte sind bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. 1. Vorbereitung von pflanzlichen Stoffen (4 Wochen) Vorbereitung auf die N. Benthamiana Pflanzen 2 säen von N. Benthamiana auf der Bodenoberfläche von jedem Pot, das Fach mit einer Plastikhaube abdecken und lassen Samen zum Keimen in einem 25 ° C, 60 % Luftfeuchtigkeit Wachstum Kammer mit einem 16/8-h hell/dunkel Photoperiode Zyklus. Nach zwei Wochen he…

Representative Results

Die β-Fass-Struktur der GFP besteht aus elf β-Stränge und kann in zwei Fragmente, die 1-10th Strand (GFP1-10OPT) und die 11th (GFP11) Strand unterteilt werden. Obwohl weder selbst fluoreszierende zwei Fragmente, kann selbst-zusammengebauten SfGFP die Fluoreszenz ausstrahlen, wenn die beiden Fragmente in der Nähe (Abbildung 1A) vorhanden sind. In diesem System, sfGFP1-10OPT- Arabidopsis oder N. Benth…

Discussion

Das hier beschriebene Protokoll dient zur Überwachung der genauen Lokalisierung der Effektor-Proteine der Wirtszelle Pflanze bei Infektion durch die bakterielle T3SS injiziert. Zuvor, Split-GFP-System diente als ein Werkzeug zur Untersuchung der subzellulären Lokalisierung von Säugetieren Proteine²³^,³⁶, Salmonellen T3E Lokalisierung und Agrobacterium VirE2 Lieferung durch das T4SS in der Pflanzenzellen³⁷. Um dieses Sys…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung wurde durch grundlegende Wissenschaft Forschungsprogramm durch die National Research Foundation von Korea (NRF) finanziert vom Ministerium für Wissenschaft, IKT und zukünftigen Raumentwicklung (NRF-2018R1A2A1A05019892), DC und durch einen Zuschuss aus Plant Molecular Breeding Center (unterstützt. PMBC) der nächsten Generation Biogreen 21 Programm der ländlichen Entwicklung Verwaltung (PJ013201), EP Wir danken dem Bildgebungszentrum Instrumentierung Nationalzentrum für das Umweltmanagement zu einem confocal Mikroskop für Dreharbeiten zur Verfügung zu stellen.

Materials

Arabidopsis transgenic lines			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10	ABRC	CS69831
NU-sfGFP1-10	ABRC	CS69832
PT-sfGFP1-10	ABRC	CS69833
MT-sfGFP1-10	ABRC	CS69834
PX-sfGFP1-10	ABRC	CS69835
ER-sfGFP1-10	ABRC	CS69836
GO-sfGFP1-10	ABRC	CS69837
PM-sfGFP1-10	ABRC	CS69838
Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmid			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10	Addgene	97387
NU-sfGFP1-10	Addgene	97388
PT-sfGFP1-10	Addgene	97389
MT-sfGFP1-10	Addgene	97390
PX-sfGFP1-10	Addgene	97391
ER-sfGFP1-10	Addgene	97392
GO-sfGFP1-10	Addgene	97393
PM-sfGFP1-10	Addgene	97394
ER-sfCherry1-10	Addgene	97403
ER-sfYFP1-10	Addgene	97404
CYTO-sfCFP1-10	Addgene	97405
sfGFP11-tagged Gateway compatible vector for T3SS-based effector delivery system			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2	Addgene	98250	pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-1-4	Addgene	98251	pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-2-2	Addgene	98252	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-2-4	Addgene	98253	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-1-2	Addgene	98254	pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-1-4	Addgene	98255	pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-2-2	Addgene	98256	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-2-4	Addgene	98257	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
Bacterial strains
Agrobacterium tumefaciens GV3101			Csaba Koncz and Jeff Schell, The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistant to gentamycin (50 ug/ml) and rifampicin (50 ug/ml)
Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500			Kvitko, B. H. et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistant to rifampicin (100 ug/ml)
Media components
Plant germination media			Add 2.165g/L Murashige & Skoog powder, 10 g/L sucrose to water. Adjust to pH 5.8 and add 2.2 g/L phytagel. Autocalve.
Murashige & Skoog medium including vitamins	Duchefa Biochemie	M0222	Store at 4 °C.
Sucrose	Duchefa Biochemie	S0809
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169
LB media			Add 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl to water. For solid media, add 15 g/L micro agar. Autoclave. Allow solution to cool to 55 °C, and add antibiotic if needed.
Tryptone	BD Bioscience	211705
Yeast extract	BD Bioscience	212750
NaCl	Duchefa Biochemie	S0520
Micro agar	Duchefa Biochemie	M1002
King's B media			10 g/L protease peptone #2, 1.5 g/L anhydrous K₂HPO₄, 15 g/L of agar to water. Autoclave. Cool down to 55 °C and add sterile 15 ml/L glycerol, 5 ml/L MgSO₄ to the medium. Add antibiotics if needed.
Proteose peptone	BD Bioscience	212120
Anhydrous K₂HPO₄	Sigma-Aldrich	1551128 USP
Glycerol	Duchefa Biochemie	G1345
MgSO₄	Sigma-Aldrich	M7506
Bacto Agar	BD Bioscience	214010
Mannitol-Glutamate (MG) liquid media			Add 10 g/L of mannitol, 2 g/L of L-glutamic acid, 0.5 g/L of KH₂PO₄, 0.2 g/L of NaCl, and 0.2 g/L of MgSO₄ to water. Adjust to pH 7
Mannitol	Duchefa Biochemie	M0803
L-glutamic acid	Duchefa Biochemie	G0707
KH₂PO₄	Sigma-Aldrich	NIST200B
Infiltration buffer			10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 µM acetosyringone. pH 5.6; Prepare a fresh buffer before use.
MES	Duchefa Biochemie	M1503	Prepare 100 mM (pH 5.6) stock in water. Filter sterilize.
MgCl₂	Sigma-Aldrich	M8266	Prepare 100 mM stock in water. Autoclave.
Acetosyringone	Sigma-Aldrich	D134406	Prepare 150 mM stock in DMSO.
Confocal microscope equipments/materials
710 laser scanning confocal system	Carl Zeiss
Axio observer Z1 inverted microscope	Carl Zeiss
Propidium iodide	ThermoFisher	P1304MP

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Lee, H., Lee, S. E., Woo, J., Choi, D., Park, E. Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection. J. Vis. Exp. (135), e57719, doi:10.3791/57719 (2018).