Proteina fluorescente verde sistema di visualizzare gli effettori consegnati dai batteri durante l'infezione Split
Summary
Approcci basati sulla proteina fluorescenti per monitorare gli effettori secernuti dai batteri nelle cellule ospiti sono impegnativi. Ciò è dovuto all’incompatibilità tra proteine fluorescenti e il sistema di secrezione di tipo III. Qui, un sistema GFP superfolder ottimizzato split viene utilizzato per la visualizzazione degli effettori secernuta dai batteri nella cellula della pianta ospite.
Abstract
Batteri, uno dei più importanti agenti causativi di varie malattie delle piante, secernono una serie di proteine effettrici nella cellula ospite pianta di sovvertire il sistema immunitario di pianta. Durante l’infezione effettori citoplasmatici sono consegnati al cytosol host tramite un tipo sistema di secrezione di III (T3SS). Dopo consegna nella cellula della pianta, il effector(s) gli obiettivi i comparti specifici per modulare i processi di cellula ospitante per la sopravvivenza e la replica dell’agente patogeno. Anche se ci sono state alcune ricerche sulla localizzazione subcellulare delle proteine effettrici nelle cellule ospiti per capire la loro funzione nella patogenicità utilizzando proteine fluorescenti, studio della dinamica degli effettori iniettati direttamente da batteri è stato impegnativo a causa di incompatibilità tra la T3SS e proteine fluorescenti.
Qui, descriviamo il nostro metodo recente di un sistema di proteina fluorescente verde superfolder di Spalato ottimizzato (sfGFPOPT) per visualizzare la localizzazione di effettori tramito il T3SS batterica nella cellula ospite. Il sfGFP11 (th 11 β-filo di sfGFP)-taggati effettrici secernuta attraverso la T3SS possono essere assemblato con un organello specifici mirato sfGFP1-10OPT (1-10th . β-filo di sfGFP) leader per l’emissione di fluorescenza nel sito. Questo protocollo fornisce una procedura per visualizzare il segnale di fluorescenza sfGFP ricostituito con una proteina da Pseudomonas syringae in un organello particolare nelle piante di Arabidopsis e Nicotiana benthamiana .
Introduction
Le piante sono organismi sessili che incontrano numerosi agenti patogeni d’invasione, inclusi batteri, funghi, virus, insetti e nematodi durante il loro ciclo di vita. Tra i fitopatogeni, i batteri patogeni Gram-negativi come Pseudomonas spp e Ralstonia spp., infettare le loro piante ospiti inserendo attraverso ferite o aperture naturali, come gli stomi e Idatodi1. Per colonizzare con successo piante ospiti, batteri patogeni si sono evolute per sviluppare una varietà di fattori di virulenza2. Quando i batteri invadono una pianta ospite, iniettano una serie di proteine di virulenza — conosciuto come effettori — direttamente nelle cellule della pianta per promuovere la loro patogenicità. Questi effettori sopprimono o modulano l’immunità innata di pianta e manipolare i processi cellulari di host per provocare la sopravvivenza batterica3.
Batteri patogeni usano principalmente un T3SS per fornire proteine effettrici direttamente in host cellule4. Il T3SS assomiglia ad una siringa molecolare con un canale di aghiformi collegare da una struttura di proteine impalcatura attraverso l’interno e le membrane batteriche esterne al sito di iniezione della cellula ospitante5. Questo meccanismo di secrezione T3SS-mediata dell’effettore (T3E) è ben conservato in vari batteri patogeni Gram-negativi della pianta così come umana. Uno degli agenti patogeni fitosanitario rappresentativo, il p. syringae pv. Pomodoro Dc3000 CRHC mutante che ha tipicamente un T3SS difettoso, ha limitato la crescita nelle piante probabilmente dovuto l’incapacità di questo mutante per sopprimere completamente la pianta immunità (iniettando proteine effettrici)6. Al momento di traslocazione in cellule dell’ospite, effettori bersaglio varie proteine ospite che sono importanti per il sistema host delle cellule, compreso le risposte di difesa della pianta, trascrizione genica, morte cellulare, proteasoma, traffico delle vescicole e ormone vie7 , 8 , 9 , 10. Pertanto, rilevamento della localizzazione cellulare delle proteine effettrici in cellule dell’ospite è un obiettivo attraente per capire le loro funzioni rispetto alla modulazione dell’immunità pianta.
La maggior parte degli studi di localizzazione della T3Es hanno impiegato la sovraespressione dell’agrobatterio –mediata con una proteina di grande fluorescenza nella pianta ospite9. Tuttavia, il metodo di espressione eterologa di geni che vengono introdotti in altre specie ha dimostrato di essere mis-localizzata o occasionalmente non-funzionali11,12,13. Inoltre, diversi studi hanno rivelato che gli effettori batterici subiscano modifiche per il targeting corretto nel host cellule14,15,16,17. Di conseguenza, espresso transitoriamente effettori nel citosol della pianta cellule non possono essere funzionalmente o quantitativamente identiche agli effettori che sono trasportati da T3SS all’agente patogeno infezione18. Inoltre, la fusione di grandi tag fluorescente da proteine effettrici potrebbe interferire con il corretto effettrici consegna e visualizzazione18,19. Pertanto, questi approcci di saggiare la funzione T3E potrebbero non corrispondere completamente la localizzazione nativa degli effettori T3SS-secreto.
Una proteina fluorescente verde (GFP) è composto da un filamento 11 β-barilotto che racchiude un filo centrale che include un cromoforo20. Waldo et al. segnalato un sistema di romanzo Spalato-GFP che consiste di un piccolo componente (GFP β filo 11; GFP11) e un grande frammento complementare (strand β di GFP 1-10; GFP1-10)21. I frammenti non reagiscono da soli ma reagiscono in su loro autoassociazione quando entrambi i frammenti sono in stretta vicinanza con l’altro. Per l’ottimizzazione dell’efficienza della proteina pieghevole, pieghevole robusti varianti della GFP, vale a dire, sfGFP e sfGFPOPT, sono state successivamente sviluppate per21,20,del sistema GFP Spalato,22. Recentemente, il singolo amminoacido mutato varianti di sfGFP1-10OPT– sfYFP1-10OPT e sfCFP1-10OPT– che può ricostituire con un frammento di sfGFP11 e fluorescenza giallo e ciano Visualizza rispettivamente, sono stati generati23 . Inoltre, sfCherry, un derivato di mCherry, può essere suddiviso in frammenti sfCherry1-10 e sfCherry11 nello stesso modo come sfGFP23.
Questo sistema è stato adattato per etichettare e traccia gli effettori T3SS in cellule HeLa durante infezione usando gli effettori da Salmonella24. Tuttavia, è stato tradotto non ottimizzato per il sistema di impianto-batterico patogeno di host. Recentemente, abbiamo ottimizzato il sistema GFP Spalato basato sul migliore sfGFP1-10OPT per monitorare la localizzazione subcellulare di T3Es consegnato da p. syringae in pianta cellule25. Per facilitare gli studi di localizzazione di T3Es a diversi compartimenti subcellulari nelle cellule della pianta, un insieme di transgeniche di Arabidopsis thaliana piante sono stati generati per esprimere sfGFP1-10OPT in vari compartimenti subcellulari 25. Inoltre, i plasmidi che trasportano una varietà di organello targeting sfGFP1-10OPT per l’ agrobatterio-mediata sovraespressione transitoria e i vettori di sfGFP11-etichetta per la consegna di basati su T3SS effettrici inoltre sono stati generati. I semi di varie linee transgeniche di Arabidopsis e i plasmidi per esprimere la T3Es di interesse possono essere ottenuti da fonti menzionate nel Tabella materiali26,27.
Nel seguente protocollo, descriviamo un sistema ottimizzato per monitorare le dinamiche degli effettori consegnati da batteri nelle cellule ospiti utilizzando il sistema di sfGFP di Spalato. Infezione di piante esprimenti sfGFP1-10OPT con transgenici Pseudomonas che trasportano il plasmide ricombinante sfGFP11 provoca una consegna dell’effettore sfGFP11-contrassegnati da Pseudomonas nella cellula ospite. Di conseguenza, queste proteine vengono ricostituite e traslocano nei comparti di destinazione effettrici specifiche. La Pseudomonas syringae pv. pomodoro Ceppo di CUCPB5500 in cui vengono eliminati gli 18 effettori, è stato utilizzato perché questo ceppo ha mostrato bassa o nessuna morte delle cellule in sia a. thaliana e N. benthamianas28. Tuttavia, tutti i materiali e i passaggi descritti qui può essere sostituiti o modificati per adattare il sistema di sfGFP di Spalato per indagine di altre domande biologiche o di ottimizzazione in condizioni di laboratorio dato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto qui è utilizzato per il monitoraggio la localizzazione esatta delle proteine effettrici iniettato dal T3SS batterica nella cellula ospite pianta al momento dell’infezione. In precedenza, il sistema GFP Spalato è stato utilizzato come strumento per studiare la localizzazione subcellulare delle proteine di mammifero23,36, Salmonella T3E localizzazione e Agrobacterium VirE2 consegna attraverso il T4SS nella impianto di cel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta dal programma di base scienza ricerca attraverso la nazionale Ricerca Fondazione della Corea (NRF) finanziato dal Ministero della scienza, ICT e pianificazione futura (NRF-2018R1A2A1A05019892) a DC e da una sovvenzione dal centro di allevamento vegetale molecolare ( PMBC) del programma di prossima generazione Biogreen 21 dell’amministrazione di sviluppo rurale (PJ013201) EP. Si ringrazia il centro di imaging del centro nazionale di strumentazione per la gestione ambientale fornire un microscopio confocale per le riprese.
Materials
| Arabidopsis transgenic lines | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| CYTO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69831 | |
| NU-sfGFP1-10 | ABRC | CS69832 | |
| PT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69833 | |
| MT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69834 | |
| PX-sfGFP1-10 | ABRC | CS69835 | |
| ER-sfGFP1-10 | ABRC | CS69836 | |
| GO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69837 | |
| PM-sfGFP1-10 | ABRC | CS69838 | |
| Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmid | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| CYTO-sfGFP1-10 | Addgene | 97387 | |
| NU-sfGFP1-10 | Addgene | 97388 | |
| PT-sfGFP1-10 | Addgene | 97389 | |
| MT-sfGFP1-10 | Addgene | 97390 | |
| PX-sfGFP1-10 | Addgene | 97391 | |
| ER-sfGFP1-10 | Addgene | 97392 | |
| GO-sfGFP1-10 | Addgene | 97393 | |
| PM-sfGFP1-10 | Addgene | 97394 | |
| ER-sfCherry1-10 | Addgene | 97403 | |
| ER-sfYFP1-10 | Addgene | 97404 | |
| CYTO-sfCFP1-10 | Addgene | 97405 | |
| sfGFP11-tagged Gateway compatible vector for T3SS-based effector delivery system | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| pBK-GW-1-2 | Addgene | 98250 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-1-4 | Addgene | 98251 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-2-2 | Addgene | 98252 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-2-4 | Addgene | 98253 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-1-2 | Addgene | 98254 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-1-4 | Addgene | 98255 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-2-2 | Addgene | 98256 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-2-4 | Addgene | 98257 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| Bacterial strains | |||
| Agrobacterium tumefaciens GV3101 | Csaba Koncz and Jeff Schell, The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistant to gentamycin (50 ug/ml) and rifampicin (50 ug/ml) | ||
| Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500 | Kvitko, B. H. et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistant to rifampicin (100 ug/ml) | ||
| Media components | |||
| Plant germination media | Add 2.165g/L Murashige & Skoog powder, 10 g/L sucrose to water. Adjust to pH 5.8 and add 2.2 g/L phytagel. Autocalve. | ||
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | Store at 4 °C. |
| Sucrose | Duchefa Biochemie | S0809 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| LB media | Add 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl to water. For solid media, add 15 g/L micro agar. Autoclave. Allow solution to cool to 55 °C, and add antibiotic if needed. | ||
| Tryptone | BD Bioscience | 211705 | |
| Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| NaCl | Duchefa Biochemie | S0520 | |
| Micro agar | Duchefa Biochemie | M1002 | |
| King's B media | 10 g/L protease peptone #2, 1.5 g/L anhydrous K2HPO4, 15 g/L of agar to water. Autoclave. Cool down to 55 °C and add sterile 15 ml/L glycerol, 5 ml/L MgSO4 to the medium. Add antibiotics if needed. | ||
| Proteose peptone | BD Bioscience | 212120 | |
| Anhydrous K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 1551128 USP | |
| Glycerol | Duchefa Biochemie | G1345 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Bacto Agar | BD Bioscience | 214010 | |
| Mannitol-Glutamate (MG) liquid media | Add 10 g/L of mannitol, 2 g/L of L-glutamic acid, 0.5 g/L of KH2PO4, 0.2 g/L of NaCl, and 0.2 g/L of MgSO4 to water. Adjust to pH 7 | ||
| Mannitol | Duchefa Biochemie | M0803 | |
| L-glutamic acid | Duchefa Biochemie | G0707 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | NIST200B | |
| Infiltration buffer | 10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 µM acetosyringone. pH 5.6; Prepare a fresh buffer before use. | ||
| MES | Duchefa Biochemie | M1503 | Prepare 100 mM (pH 5.6) stock in water. Filter sterilize. |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Prepare 100 mM stock in water. Autoclave. |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | Prepare 150 mM stock in DMSO. |
| Confocal microscope equipments/materials | |||
| 710 laser scanning confocal system | Carl Zeiss | ||
| Axio observer Z1 inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| Propidium iodide | ThermoFisher | P1304MP | |
References
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