En Neurosphere analysen vurdere endogene nevrale stamceller aktivering i en musemodell av Minimal ryggmargsskade
Summary
Her viser vi ytelsen til en minimal ryggmargen skaden modell i en voksen mus som sparer sentrale kanalen nisje bolig endogene nevrale stamceller (NSCs). Vi viser hvordan neurosphere analysen kan brukes å kvantifisere aktivisering og migrering av definitive og primitive NSCs etter skade.
Abstract
Nevrale stamceller (NSCs) i voksen pattedyr ryggmargen er relativt mitotically quiescent innbyggere periventricular celler som kan bli studert i vitro med neurosphere analysen. Denne colony-forming analysen er et kraftig verktøy for å studere svaret av NSCs ytre faktorene i en rett; men kan dette også brukes til å studere effekten av i vivo manipulasjoner med riktig forståelse av styrker og begrensninger av analysen. En manipulering av klinisk interessen er effekten av skade på endogene NSC aktivisering. Aktuelle modeller for ryggmargsskade gir en utfordring å studere dette alvorlighetsgraden av felles contusion, komprimering og transection modeller forårsake ødeleggelse av NSC nisje på området av skaden stamceller ligger. Her beskriver vi en minimal skade modell som forårsaker lokaliserte skade på overfladisk dorsolateral overflaten av lavere thorax nivå (T7/8) i ryggmargen voksen mus. Skade modellen deler det sentrale kanalen på nivå med skade og tillater analyse av NSCs som finnes på nivået av lesjonen på ulike tidspunkt etter skade. Her viser vi hvordan neurosphere analysen kan benyttes for å studere aktivering av to forskjellige, lineally-relatert, befolkningen i NSCs som ligger i ryggmargen periventricular regionen – primitive og definitive NSCs (pNSCs og dNSCs, henholdsvis). Vi viser hvordan å isolere og kultur disse NSCs fra periventricular regionen på skade og hvit substans skade området. Vår post-kirurgiske ryggmargen disseksjoner viser økte antall pNSC og dNSC-avledet neurospheres fra periventricular regionen skadet ledninger sammenlignet med kontroller, taler til deres aktivisering via skade. Videre etter skade, dNSC-avledet neurospheres kan isoleres fra skade området-demonstrere evnen til NSCs å migrere fra deres periventricular nisje områder for skade.
Introduction
Sentralnervesystemet inneholder en subpopulasjon av selv fornyende, multipotent stamceller som har kapasitet til å gi opphav til alle forskjellige modne nevrale cellen typer1,2,3,4. Disse nevrale stamceller (NSCs) bor i spesialiserte nisjer i hjernen og ryggmarg og kan aktiveres etter skade sprer, overføre og skille ut modne neural celler. NSCs og deres avkom har vist å migrere til skade området i kortikale skader modeller5,6. I hjernen, har NSCs blitt vist å migrere fra laterale ventriklene til webområdet for skade der de differensieres til astrocyttene som bidrar til glial arr formasjon7. I ryggmargen, men har noen studier vært gjort for å spørre om disse samme endogene NSCs kan bli brukt til å fremme utvinningen ryggmargsskade. Faktisk er det for tiden en debatt om aktivisering stamcelletransplantasjon bassenget i ryggmargen trenger en direkte fysisk skade på periventricular nisje lining den sentrale kanal8 eller hvis skaden til spinal cord parenchyma (forlater stammen cellen nisje intakt) er tilstrekkelig for å aktivere endogene NSCs9.
En rekke ryggmargen skaden (SCI) modeller har blitt brukt til å studere i Patofysiologien ved akutt og kronisk personskade. Disse modellene har også blitt brukt til å teste potensielle terapi for å behandle SCI gjennom neuroprotection, immunomodulation og utvikle cellen transplantasjon/utskifting strategier10,11,13. Modellene inkluderer komprimering og/eller contusion skader, som forårsake store funksjonelle underskudd samt omfattende lesjoner og cavitations i ledningen14,15. Resulterende glial arr kan omfatte flere spinal segmenter med fleste bredde/omkretsen av ryggmargen16. Således, mens disse modellene er klinisk relevante, de råd betydelige utfordringer å studere responsen av endogene NSCs etter skade. Det er kjemisk modeller for skade som kan tilpasses for å forårsake mildere former for skade som kan spare de sentrale kanal17. Men disse typer skader fokus på demyelinisering knyttet til SCI og er ikke klinisk relevante modeller for fysisk og/eller mekaniske skader forbundet med traumatisk SCI.
For å løse begrensningene for skade modellene, har vi tilpasset en nål spor minimal SCI modell, opprinnelig utviklet i rotte9, for programmet på en voksen musemodell. Våre tilpasset skade modellen kan opprette en konsekvent leksjonen i dorsolateral regionen i ryggmargen musen og spare canal central på nivåer av skade. Fordelen med denne modellen er at den tillater studiet av NSC kinetics etter skade og potensielle radial flytting til området av skade. Bruk av en musemodell tillater også bruk av transgene mus at linjen sporing av endogene NSCs og deres avkom etter skade. Egenskapene for NSCs kan videre vurderes bruker en modifisert form for i vitro neurosphere analysen som er innført i denne protokollen.
Neurosphere analysen er i vitro colony-forming analysen som gir isolasjon av NSCs i nærvær av mitogens. På klonal plating tettheter sprer personlige NSCs for å gi opphav til frittflytende sfærisk kolonier som består av en liten subpopulasjon av NSCs og et stort flertall av progenitors18,19. Våre protokollen, vi viser isolering av to forskjellige, lineally-relaterte NSCs fra periventricular regionen i ryggmargen, under grunnlinjen forhold og følge vår minimal SCI-modell. Definitive nevrale stilk celler (dNSCs) express nestin og glial fibrillary Sure protein (GFAP) og dyrkes i nærvær av epidermal vekstfaktor (EGF), fibroblast vekstfaktor (FGF) og heparin (sammen kalt EFH)20. Disse dNSCs er sjeldne i ryggmargen naiv, gir opphav til svært få neurospheres i vitro. Vi viser imidlertid at dNSCs er aktivert etter minimal SCI, utvide antall neurospheres isolert fra periventricular regionen21. Primitive nevrale stamceller (pNSCs) er over dNSCs i nevrale stamceller avstamning. pNSCs er svært sjelden, uttrykke lave nivåer av pluripotency merket Oct4, og leukemi hemmende faktor (LiF) forståelsesfull22. pNSCs utgjør ikke neurospheres når isolert fra voksen mus ryggmargen av myelin basic protein (MBP) i primære kulturer; men pNSC neurospheres kan isoleres fra MBP mangelfull mus og tallene er utvidet følgende skade-ligner dNSCs21. Endelig viser vi at dNSC-avledet neurospheres kan være isolert fra stedet av skader på tidlig ganger etter minimal SCI. Disse funnene viser at våre skade modellen og analyser kan vurdere aktivisering kjennetegner periventricular NSCs som deres evne til å spre og overføre svar på skader.
Protocol
Representative Results
Discussion
Under den kirurgiske prosedyren finnes det noen viktige trinn der forskeren bør være spesielt oppmerksom på for å få optimale resultater og minimere variasjon mellom dyr. Hensyn må tas med i inhalert anestesi (isoflurane) under operasjonen som anesthetic har vist seg å ha neuroprotective effekter med langvarig eksponering27. Følgelig når studere regenerative kapasiteten i ryggmargen etter skade, gjøre en innsats for å utføre kirurgi så raskt og effektivt som mulig for å unngå forvir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet er finansiert av Krembil Foundation (drift grant CMM). WX var Carlton Marguerite Smith student pris. NL mottatt en Ontario Graduate Scholarship.
Materials
| Agricola Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Moria Vannas-Wolff Spring Scissors (Curved) | Fine Science Tools | 15370-50 | Customize when ordering to get blunted tips |
| Graefe Forceps (Straight, 1×2 Teeth) | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated) | Fine Science Tools | 11152-10 | Or any other forceps for suturing |
| Hartman Hemostats (Straight) | Fine Science Tools | 13002-10 | Or any other appropriate for suturing |
| Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Or any other appropriate |
| Hair clippers | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA | or any other appropriate |
| Stereotaxic instrument | Stoeling | 51500 | or any other appropriate |
| Buprenorphine | or any appropirate sanctioned my animal care facility | ||
| Meloxicam | or any appropriate sanctioned by animal care facility | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE | or any other appropriate |
| Isoflurane | Baxter International Inc | DIN 02225875 | or any other appropriate for anesthesia |
| Q-tips Cottom Swabs | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS | |
| Cotton Gauze | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| 30G Needles | Becton Dickinson | 305106 | For Injury |
| 25G Needles | Becton Dickinson | 305122 | For Drug injections |
| 1mL Syringes | Becton Dickinson | 3090659 | for drug injections |
| 3mL Syringes | Becton Dickinson | 309657 | for fluid injections |
| 4-0 Suture | uoftmedstore.com | 2297-VS881 | for skin suturing |
| 6-0 Suture | uoftmedstore.com | VS889 | for muscle suturing |
| Polysporin ointment | amazon.ca | 102051 | |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 901806 | |
| 15mL conical tubes | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Petri Dishes | ThermoFisher | any appropriate | |
| Trypan Blue | ThermoFisher | Any | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Centrifuge | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Counting Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Neural Basal-A Medium | Invitrogen | 10888-022 | |
| B27 | Invitrogen | 17404-044 | |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15070 | |
| L- Glutamine | Gibco | 25030 | |
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |
| F12 | Invitrogen | 12700075 | |
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | 1M- 9.01g in 100mL dH2O |
| 1M Glucose | |||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | 155mM- 1.30g in 100mL dH2O |
| 155mM NaHCO3 | |||
| 1M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g in 100mL dH2O |
| Apo-Transferrin | R&D Systems | 3188-AT | |
| Putrescine | Sigma | P7505 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Selenium | Sigma | S9133 | |
| Progesterone | Sigma | P6149 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | 1 vial of papain can be used for 2 samples |
| Epidermal Growth Factor | Invitrogen | PMG8041 | Powder reconstituted with 1mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
| Fibroblast Growth Factor | Invitrogen | PHG0226 | Powder reconstituted with 0.5mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | In House | ||
| Trypan Blue | |||
| Hemocytometer | |||
| 24 well Plates | NUNC | ||
| 2M NaCl | Sigma | S5886 | 11.69g in 100mL dH2O |
| 1M KCL | Sigma | P5405 | 7.46g in 100mL dH2O |
| 1M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33g in 100mL dH2O |
| 108mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59g in 100mL dH2O |
References
- Johansson, C. B., et al. Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell. 96 (1), 25-34 (1999).
- McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276 (5309), 66-71 (1997).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), 1433-1438 (2000).
- Temple, S., Alvarez-Buylla, A. Stem cells in the adult mammalian central nervous system. Current Opinion in Neurology. 9 (1), 135-141 (1999).
- Zhang, R., et al. Activated neural stem cells contribute to stroke-induced neurogenesis and neuroblast migration toward the infarct boundary in adult rats. Journal Of Cerebral Blood Flow And Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
- Komitova, M., Mattsson, B., Johansson, B. B., Eriksson, P. S. Enriched environment increases neural stem/progenitor cell proliferation and neurogenesis in the subventricular zone of stroke-lesioned adult rats. Stroke. 36 (6), 1278-1282 (2005).
- Faiz, M., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone give rise to reactive astrocytes in the cortex after stroke. Cell Stem Cell. 17 (5), 624-634 (2015).
- Ren, Y., et al. Ependymal cell contribution to scar formation after spinal cord injury is minimal, local and dependent on direct ependymal injury. Science Reports – UK. 7, (2017).
- Mothe, A. J., Tator, C. H. Proliferation, migration, and differentiation of endogenous ependymal region stem/progenitor cells following minimal spinal cord injury in the adult rat. Neuroscience. 131 (1), 177-187 (2005).
- Thuret, S., Moon, L. D., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nature Reviews Neuroscience. 7 (8), 628-643 (2006).
- Bethea, J. R., et al. Systemically administered interleukin-10 reduces tumor necrosis factor-alpha production and significantly improves functional recovery following traumatic spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 16 (10), 851-863 (1999).
- Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 209 (2), 378-388 (2008).
- Cummings, B. J., et al. Human neural stem cells differentiate and promote locomotor recovery in spinal cord-injured mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (39), 14069-14074 (2005).
- Beattie, M. S., Hermann, G. E., Rogers, R. C., Bresnahan, J. C. Cell death in models of spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 37-47 (2002).
- Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
- Faulkner, J. R., et al. Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).
- Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
- Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay. Neural Cell Transplantation: Methods and Protocols. , 91-101 (2009).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nature Methods. 3 (10), (2006).
- Mignone, J. L., Kukekov, V., Chiang, A. S., Steindler, D., Enikolopov, G. Neural stem and progenitor cells in nestin-GFP transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 469 (3), 311-324 (2004).
- Xu, W., et al. Myelin basic protein regulates primitive and definitive neural stem cell proliferation from the adult spinal cord. Stem Cells. 35 (2), 485-496 (2017).
- Sachewsky, N., et al. Primitive neural stem cells in the adult mammalian brain give rise to GFAP-expressing neural stem cells. Stem Cell Reports. 2 (6), 810-824 (2014).
- Mothe, A., Tator, C. H. Isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
- Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Xiong, L., et al. Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats. Anesthesia and Analgesia. 96 (1), 233-237 (2003).
- Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
- Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
