Um ensaio de Neurosphere para avaliar a ativação de células-tronco neurais endógena em um modelo do rato da lesão medular mínima
Summary
Aqui, vamos demonstrar o desempenho de um modelo de lesão medular mínima em um rato adulto que poupa o nicho central canal habitação endógena células tronco neurais (NSCs). Mostramos como o ensaio de neurosphere pode ser usado para quantificar a ativação e migração de NSCs definitivos e primitivos, após lesão.
Abstract
Células-tronco neurais (NSCs) na medula espinhal dos mamíferos adulta são uma população relativamente mitotically quiescente de periventriculares células que podem ser estudados em vitro usando o ensaio de neurosphere. Este ensaio formadoras é uma poderosa ferramenta para estudar a resposta de NSCs para fatores exógenos em um prato; no entanto, isto também pode ser usado para estudar o efeito de manipulações na vivo com a compreensão apropriada dos pontos fortes e limitações do ensaio. Uma manipulação do interesse clínico é o efeito da lesão na ativação endógena do NSC. Modelos atuais de lesão da medula espinhal fornecem um desafio para estudar isto como a gravidade dos modelos comuns de contusão, compressão e transecção causar a destruição do nicho NSC no local da lesão onde residem as células-tronco. Aqui, descrevemos um modelo de lesão mínima que causa danos localizados na superfície dorsolateral superficial do piso inferior torácica (T7/8) da medula espinhal rato adulto. Este modelo de lesão poupa o canal central ao nível da lesão e permite a análise de NSCs que residem no nível da lesão em vários pontos de tempo após lesão. Aqui, nós mostramos como o ensaio de neurosphere pode ser utilizado para estudar a ativação de duas populações distintas, relacionadas com lineally, de NSCs que residem na região periventricular da medula espinhal – NSCs primitivos e definitivos (pNSCs e dNSCs, respectivamente). Demonstramos como isolar e cultura estes NSCs da região ao nível da lesão e o local da lesão de substância branca periventricular. Nossas dissecações pós-cirúrgica da medula espinhal mostram aumento do número de pNSC e neurospheres dNSC-derivado da região periventricular das cordas feridas comparados aos controles, falando de sua ativação através de lesão. Além disso, após lesão, neurospheres dNSC-derivado pode ser isolado do local da lesão — demonstrando a capacidade de NSCs para migrar do seu nicho periventricular para locais de ferimento.
Introduction
O sistema nervoso central contém uma subpopulação de células-tronco multipotentes, auto renovadora que têm a capacidade de dar origem a todas as células nervosas maduro diferentes tipos1,2,3,4. Essas células-tronco neurais (NSCs) residem em nichos especializados do cérebro e da medula espinhal e pode ser ativadas após lesão para proliferar, migrar e se diferenciar em células maduras neurais. NSCs e seus descendentes foram mostrados para migrar para o local da lesão, em lesão cortical modelos5,6. No cérebro, NSCs foram mostrados para migrar dos ventrículos laterais para o local da lesão, onde eles se diferenciar em astrócitos que contribuem para a formação de cicatriz glial7. Na medula espinhal, no entanto, poucos estudos foram feitos para perguntar se esses mesmos NSCs endógenos podem ser aproveitados para promover a recuperação após a lesão da medula espinhal. De fato, atualmente há um debate sobre se a ativação da pilha de haste piscina na medula espinhal exige um dano físico direto do nicho periventriculares revestem o canal central8 ou se os danos para a coluna vertebral cabo parênquima (deixando o tronco nicho de célula intacto) é suficiente para ativar endógena NSCs9.
Um número de modelos de lesão (SCI) da medula espinhal têm sido utilizado para estudar a fisiopatologia da lesão aguda e crônica. Estes modelos também tem sido usados para testar potenciais terapias para tratar SCI através de neuroproteção, imunomodulação e desenvolvimento celular transplante/substituição estratégias10,11,13. Modelos atuais incluem compressão e/ou contusão lesões, que causam déficits funcionais em grande escala, bem como lesões extensas e cavitações no cabo14,15. Cicatrizes gliais resultantes podem abranger diversos segmentos da coluna vertebral juntamente com a maioria de largura/circunferência do16da medula espinhal. Assim, enquanto estes modelos são clinicamente relevantes, arranjaram um desafio significativo para estudar a resposta de NSCs endógenas após lesão. Existem modelos de químicos da lesão que pode ser adaptado para causar formas mais leves de lesão que pode poupar o canal central17. No entanto, esses tipos de lesão focar a desmielinização associada com SCI e não são modelos clinicamente relevantes para o dano físico e/ou mecânico associado com Sci traumático.
Para lidar com as limitações dos modelos de lesão atual, nós adaptamos um agulha faixa mínima SCI modelo, originalmente desenvolvido no rato9, para a aplicação em um modelo do rato adulto. Nosso modelo de lesão adaptado pode criar uma lesão consistente na região dorsolateral da medula espinhal do mouse e poupar o canal central para o nível da lesão. A vantagem desse modelo é que ele permite o estudo da cinética de NSC após lesão e sua potencial migração radial para o local da lesão. O uso de um modelo de mouse também permite o uso de ratos transgénicos que permitem o monitoramento de linhagem de NSCs endógenos e seus descendentes após lesão. As propriedades do NSCs mais podem ser avaliadas usando uma forma modificada do ensaio em vitro neurosphere que é introduzida no presente protocolo.
O ensaio de neurosphere é um em vitro formadoras ensaio que permite o isolamento de NSCs na presença de mitógenos. Em densidades de chapeamento clonal, NSCs individuais proliferam para dar origem a colônias esféricas flutuantes de células que são compostas por uma pequena subpopulação de NSCs e uma grande maioria dos progenitores18,19. Em nosso protocolo, demonstramos o isolamento de duas distintas, relacionadas a lineally NSCs da região periventricular da medula espinhal — sob condições de linha de base e seguir nosso modelo SCI mínimo. Definitiva neural da haste nestin expressa de células (dNSCs) e a proteína ácida fibrilar glial (GFAP) e são cultivados na presença de fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento fibroblástico (FGF) e heparina (juntos denominada EFH)20. Estes dNSCs são raros na medula espinhal ingênuo, dando origem a muito poucas neurospheres em vitro. No entanto, mostramos que os dNSCs são ativados mínimo SCI, expandindo os números dos neurospheres isolada da região periventricular21a seguir. Células-tronco neurais primitivas (pNSCs) estão a montante do dNSCs na linhagem de células-tronco neurais. pNSCs são excessivamente raros, expressos níveis baixos do marcador pluripotência Oct4 e leucemia responsivo de fator inibitório (LiF)22. pNSCs não formam neurospheres quando isoladas de rato adulto medula espinhal devido à presença de proteína básica de mielina (MBP) em culturas primárias; no entanto, pNSC neurospheres pode ser isolado de ratos deficientes de MBP e seus números são lesões seguintes expandida — semelhantes a dNSCs21. Finalmente, mostramos que neurospheres dNSC-derivado pode ser isolado do local da lesão em cedo vezes seguindo mínimo Sci. Estes resultados demonstram que o nosso modelo de lesão e ensaios podem avaliar as características de ativação de periventriculares NSCs tais como sua capacidade de proliferar e migrar em resposta a lesões.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante o procedimento cirúrgico, existem alguns passos críticos onde o pesquisador deve prestar particular atenção a fim de obter resultados óptimos e minimizar a variabilidade entre os animais. Deve ter cuidado com a anestesia inalada (isoflurano) durante a cirurgia como anestésico foi mostrado para ter efeitos neuroprotective com exposição prolongada27. Nesse sentido, ao estudar a capacidade regenerativa da medula espinhal após lesão, fazer um esforço para realizar a cirurgia, mais r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é financiado pela Fundação Krembil (subvenção de funcionamento CMM). WX foi o destinatário do prêmio estudante Carlton Marguerite Smith. NL recebeu uma bolsa de pós-graduação de Ontário.
Materials
| Agricola Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Moria Vannas-Wolff Spring Scissors (Curved) | Fine Science Tools | 15370-50 | Customize when ordering to get blunted tips |
| Graefe Forceps (Straight, 1×2 Teeth) | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated) | Fine Science Tools | 11152-10 | Or any other forceps for suturing |
| Hartman Hemostats (Straight) | Fine Science Tools | 13002-10 | Or any other appropriate for suturing |
| Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Or any other appropriate |
| Hair clippers | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA | or any other appropriate |
| Stereotaxic instrument | Stoeling | 51500 | or any other appropriate |
| Buprenorphine | or any appropirate sanctioned my animal care facility | ||
| Meloxicam | or any appropriate sanctioned by animal care facility | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE | or any other appropriate |
| Isoflurane | Baxter International Inc | DIN 02225875 | or any other appropriate for anesthesia |
| Q-tips Cottom Swabs | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS | |
| Cotton Gauze | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| 30G Needles | Becton Dickinson | 305106 | For Injury |
| 25G Needles | Becton Dickinson | 305122 | For Drug injections |
| 1mL Syringes | Becton Dickinson | 3090659 | for drug injections |
| 3mL Syringes | Becton Dickinson | 309657 | for fluid injections |
| 4-0 Suture | uoftmedstore.com | 2297-VS881 | for skin suturing |
| 6-0 Suture | uoftmedstore.com | VS889 | for muscle suturing |
| Polysporin ointment | amazon.ca | 102051 | |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 901806 | |
| 15mL conical tubes | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Petri Dishes | ThermoFisher | any appropriate | |
| Trypan Blue | ThermoFisher | Any | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Centrifuge | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Counting Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Neural Basal-A Medium | Invitrogen | 10888-022 | |
| B27 | Invitrogen | 17404-044 | |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15070 | |
| L- Glutamine | Gibco | 25030 | |
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |
| F12 | Invitrogen | 12700075 | |
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | 1M- 9.01g in 100mL dH2O |
| 1M Glucose | |||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | 155mM- 1.30g in 100mL dH2O |
| 155mM NaHCO3 | |||
| 1M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g in 100mL dH2O |
| Apo-Transferrin | R&D Systems | 3188-AT | |
| Putrescine | Sigma | P7505 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Selenium | Sigma | S9133 | |
| Progesterone | Sigma | P6149 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | 1 vial of papain can be used for 2 samples |
| Epidermal Growth Factor | Invitrogen | PMG8041 | Powder reconstituted with 1mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
| Fibroblast Growth Factor | Invitrogen | PHG0226 | Powder reconstituted with 0.5mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | In House | ||
| Trypan Blue | |||
| Hemocytometer | |||
| 24 well Plates | NUNC | ||
| 2M NaCl | Sigma | S5886 | 11.69g in 100mL dH2O |
| 1M KCL | Sigma | P5405 | 7.46g in 100mL dH2O |
| 1M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33g in 100mL dH2O |
| 108mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59g in 100mL dH2O |
References
- Johansson, C. B., et al. Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell. 96 (1), 25-34 (1999).
- McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276 (5309), 66-71 (1997).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), 1433-1438 (2000).
- Temple, S., Alvarez-Buylla, A. Stem cells in the adult mammalian central nervous system. Current Opinion in Neurology. 9 (1), 135-141 (1999).
- Zhang, R., et al. Activated neural stem cells contribute to stroke-induced neurogenesis and neuroblast migration toward the infarct boundary in adult rats. Journal Of Cerebral Blood Flow And Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
- Komitova, M., Mattsson, B., Johansson, B. B., Eriksson, P. S. Enriched environment increases neural stem/progenitor cell proliferation and neurogenesis in the subventricular zone of stroke-lesioned adult rats. Stroke. 36 (6), 1278-1282 (2005).
- Faiz, M., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone give rise to reactive astrocytes in the cortex after stroke. Cell Stem Cell. 17 (5), 624-634 (2015).
- Ren, Y., et al. Ependymal cell contribution to scar formation after spinal cord injury is minimal, local and dependent on direct ependymal injury. Science Reports – UK. 7, (2017).
- Mothe, A. J., Tator, C. H. Proliferation, migration, and differentiation of endogenous ependymal region stem/progenitor cells following minimal spinal cord injury in the adult rat. Neuroscience. 131 (1), 177-187 (2005).
- Thuret, S., Moon, L. D., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nature Reviews Neuroscience. 7 (8), 628-643 (2006).
- Bethea, J. R., et al. Systemically administered interleukin-10 reduces tumor necrosis factor-alpha production and significantly improves functional recovery following traumatic spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 16 (10), 851-863 (1999).
- Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 209 (2), 378-388 (2008).
- Cummings, B. J., et al. Human neural stem cells differentiate and promote locomotor recovery in spinal cord-injured mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (39), 14069-14074 (2005).
- Beattie, M. S., Hermann, G. E., Rogers, R. C., Bresnahan, J. C. Cell death in models of spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 37-47 (2002).
- Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
- Faulkner, J. R., et al. Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).
- Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
- Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay. Neural Cell Transplantation: Methods and Protocols. , 91-101 (2009).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nature Methods. 3 (10), (2006).
- Mignone, J. L., Kukekov, V., Chiang, A. S., Steindler, D., Enikolopov, G. Neural stem and progenitor cells in nestin-GFP transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 469 (3), 311-324 (2004).
- Xu, W., et al. Myelin basic protein regulates primitive and definitive neural stem cell proliferation from the adult spinal cord. Stem Cells. 35 (2), 485-496 (2017).
- Sachewsky, N., et al. Primitive neural stem cells in the adult mammalian brain give rise to GFAP-expressing neural stem cells. Stem Cell Reports. 2 (6), 810-824 (2014).
- Mothe, A., Tator, C. H. Isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
- Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Xiong, L., et al. Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats. Anesthesia and Analgesia. 96 (1), 233-237 (2003).
- Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
- Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
