Evaluatie van de rol van mitochondriale functie in moeheid in verband met kanker
Summary
Ons doel was het ontwikkelen van een praktische protocol om te evalueren van de mitochondriale dysfunctie vermoeidheid bij kankerpatiënten is gekoppeld. Dit innovatieve protocol is geoptimaliseerd voor klinisch gebruik waarbij alleen standaard phlebotomy en basic Labor procedures.
Abstract
Vermoeidheid is een gemeenschappelijk en het afmatten voorwaarde dat de meeste patiënten met kanker beïnvloedt. Tot op heden, test vermoeidheid blijft slecht gekenmerkt met geen diagnostische voor objectief maatregel de ernst van deze aandoening. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde methode voor de beoordeling van de mitochondriale functie van PBMCs verzameld uit vermoeid kankerpatiënten. Met een compacte extracellulaire flux-systeem en de sequentiële injectie van respiratoire remmers, onderzochten we PBMC mitochondriale functionele status door het meten van de basale mitochondriale ademhaling en luchtwegen reservecapaciteit energie fenotype, waarin wordt beschreven het traject van de voorkeur energie om te reageren op stress. Verse PBMCs zijn beschikbaar in de klinische setting met behulp van standaard phlebotomy. De hele test beschreven in dit protocol kan worden afgerond in minder dan 4 uur zonder de betrokkenheid van complexe biochemische technieken. Daarnaast beschrijven we een normalisatie-methode die nodig is voor reproduceerbare gegevens te verkrijgen. De eenvoudige procedure en de normalisatie methoden gepresenteerd mogelijk voor herhaalde sample collectie van dezelfde patiënt en generatie van reproduceerbare gegevens die kunnen worden vergeleken tussen de tijdstippen te evalueren van potentiële effecten van de behandeling.
Introduction
Vermoeidheid is een overwegend en pijnlijke aandoening die een negatief effect op de kwaliteit van leven van kanker patiënten1 heeft. Tot op heden, kanker vermoeidheid blijft slecht gedefinieerde en vertrouwt alleen op subjectieve rapportage door patiënten2. Daarom is er dringend behoefte aan een eenvoudig aan te passen diagnostisch laboratoriumtest objectief karakteriseren vermoeidheid in de klinische setting3,4te identificeren.
Meerdere onderliggende mechanismen, met inbegrip van de mitochondriën dysfunctie, hebben voorstellen gedaan tot vermoeidheid5. Mitochondriën zijn de krachtpatser organellen, met 95% van cellulaire energiebehoefte via oxidatieve fosforylatie, en een belangrijke rol spelen bij calcium signalering, apoptosis, immuun signalering en regulering van de andere intracellulaire signalering gebeurtenissen6 . Dienovereenkomstig, verminderde mitochondriale Bioenergetica en gebreken in de energieproductie kunnen bijdragen aan vermoeidheid. Ter ondersteuning van deze hypothese, hebben vorige studies waargenomen mutaties in het mitochondriaal DNA bij patiënten met chronische vermoeidheid syndroom7. Terwijl het blijft onduidelijk of de pathofysiologische oorsprong van vermoeidheid ligt binnen het centrale zenuwstelsel of perifere weefsels, zoals skeletspieren8,9, is er momenteel geen directe methode om nauwkeurig beoordelen mitochondriale dysfunctie gerelateerde tot vermoeidheid in live, respiring cellen.
Met behulp van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) te bestuderen van mitochondriale functie biedt een aantal voordelen. Eerst PBMCs zijn beschikbaar in de klinische setting met behulp van standaard phlebotomy en kunnen worden geïsoleerd snel met behulp van eenvoudige laboratoriumtechnieken. Ten tweede, is de bloedinzameling minder invasief dan het verzamelen van andere weefsels zoals een biopsie van spier. Zo kunnen bloedmonsters worden verzameld uit de dezelfde patiënt herhaaldelijk na verloop van tijd, dat longitudinale beoordeling van de effecten van de behandeling vergemakkelijkt. Interessant, leek mitochondriale functie in PBMCs te worden goed gecorreleerd met nier mitochondriale status in een diermodel10. Bovendien hebben immuun cel mitochondriën is gebruikt als een proxy voor het opsporen van systemische veranderingen onder andere ziekte voorwaarden11,12. Mitochondriën in circulerende immune cellen zijn vooral gevoelig voor veranderingen in immuun functies en immuun signalering van moleculen zoals cytokines13,14,15. Men heeft bijvoorbeeld opgemerkt dat PBMCs van patiënten met acute reumatische inflammatoire ziekten hoge basislijn zuurstof verbruik14 vertonen. Daarentegen was zuurstofverbruik in PBMCs geïsoleerd van patiënten met systemische inflammatoire voorwaarden waaronder sepsis16verlaagd. Inflammatoire voorwaarden, kunnen de vrije radicalen geproduceerd door disfunctionele mitochondriën verder bijdragen tot verhoogde oxidatieve stress en langdurige ontsteking17. De centrale rol van mitochondria in de productie van de energie zo goed zoals in oxidatieve stress suggereert het potentiële nut van het gebruik van mitochondriale functie als een proxy voor de studie van vermoeidheid in kanker patiënten 13.
Eerdere studies onderzoeken van mitochondriale functie gebruikt biochemische technieken, mitochondriale membraan potentiële meting of isolatie van specifieke cel populaties die niet mag gemakkelijk aanpasbaar in de klinische setting5, 14,18. In de afgelopen jaren de ontwikkeling van extracellulaire flux tests hebben onderzoekers gemakkelijk en nauwkeurig onderzoeken van wijzigingen in zuurstof verbruik tarief (OCR) in reactie op geautomatiseerde injecties van respiratoire remmers19,20 , 21 , 22. echter, de meeste van deze studies zijn ontworpen voor specifieke celtypes en het grote formaat van de hoge gegevensdoorvoer mogelijk niet van toepassing in een klinische setting. In dit manuscript beschrijven we een geoptimaliseerde protocol voor de behandeling van mitochondriale functie voor klinisch gebruik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vermoeidheid bij kankerpatiënten is een invaliderende aandoening die is niet goed gedefinieerd of1gekenmerkt. Diagnose van vermoeidheid is volledig gebaseerd op subjectieve rapportage en er is geen huidige diagnostische standaard of behandeling voor deze aandoening, grotendeels te wijten aan een gebrek aan inzicht in de pathobiology2. Van de voorgestelde mechanismen ten grondslag liggen aan de vermoeidheid bij kankerpatiënten, is bijzondere waardeverminderingen in mitocho…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie is volledig ondersteund door de divisie van intramurale onderzoek van het National Institute of Nursing Research van de NIH, Bethesda, Maryland.
Materials
| CPT Mononuclear Cells Preparation Tube | BD Biosciences | 362761 | For isolating PBMCs following phlebotomy |
| RPMI-1640 | Corning | 10-040 | For making growth media for PBMCs |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | For making growth media for PBMCs |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | For making growth media for PBMCs |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface |
| Seahorse XF Calibrant Solution | Agilent | 103059-000 | For hydrating cartridges |
| XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges) | Agilent | 103022-100 | Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges |
| XF base media | Agilent | 103335-100 | For making XF assay media |
| 45% cell culture D-(+)-Glucose solution | Corning | 25-037-CI | For making XF assay media |
| Sodium pyruvate solution | Corning | 25-000-CI | For making XF assay media |
| L-glutamine solution | ThermoFisher | 25030081 | For making XF assay media |
| Seahorse XFp Mito Stress Test Kit | Agilent | 103010-100 | Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone |
| CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay | ThermoFisher | C35011 | For quantification of live cells and data normalization |
| Seahorse XFp Analyzer | Agilent | S7802AEA | For measuring mitochondrial function in live cells |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate) | BioTek | BTCYT5PV | For quantification of live cells and data normalization |
References
- Berger, A. M., et al. Cancer-Related Fatigue, Version 2.2015. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 13 (8), 1012-1039 (2015).
- Feng, L. R., Dickinson, K., Kline, N., Saligan, L. N. Different phenotyping approaches lead to dissimilar biologic profiles in men with chronic fatigue following radiation therapy. Journal of Pain and Symptom Management. 52 (6), 832-840 (2016).
- Feng, L. R., et al. Clinical Predictors of Fatigue in Men With Non-Metastatic Prostate Cancer Receiving External Beam Radiation Therapy. Clinical Journal of Oncology Nursing. 19 (6), 744-750 (2015).
- Feng, L. R., Wolff, B. S., Lukkahatai, N., Espina, A., Saligan, L. N. Exploratory Investigation of Early Biomarkers for Chronic Fatigue in Prostate Cancer Patients Following Radiation Therapy. Cancer Nursing. 40 (3), 184-193 (2017).
- Myhill, S., Booth, N. E., McLaren-Howard, J. Chronic fatigue syndrome and mitochondrial dysfunction. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 2 (1), 1-16 (2009).
- Pernas, L., Scorrano, L. Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function. Annual Review of Physiology. 78 (1), 505-531 (2016).
- Vecchiet, L., et al. Sensory characterization of somatic parietal tissues in humans with chronic fatigue syndrome. Neuroscience Letters. 208 (2), 117-120 (1996).
- Jones, D. E. J., Hollingsworth, K. G., Taylor, R., Blamire, A. M., Newton, J. L. Abnormalities in pH handling by peripheral muscle and potential regulation by the autonomic nervous system in chronic fatigue syndrome. Journal of Internal Medicine. 267 (4), 394-401 (2010).
- Feng, L. R., Suy, S., Collins, S. P., Saligan, L. N. The role of TRAIL in fatigue induced by repeated stress from radiotherapy. Journal of Psychiatric Research. 91, 130-138 (2017).
- Karamercan, M. A., et al. Can peripheral blood mononuclear cells be used as a proxy for mitochondrial dysfunction in vital organs during hemorrhagic shock and resuscitation. Shock. 40 (6), (2013).
- Ijsselmuiden, A. J. J., et al. Circulating white blood cells and platelets amplify oxidative stress in heart failure. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 5, 811 (2008).
- Kong, C. -. W., et al. Leukocyte mitochondrial alterations after cardiac surgery involving cardiopulmonary bypass: Clinical correlations. Shock. 21 (4), 315-319 (2004).
- Straub, R. H. The brain and immune system prompt energy shortage in chronic inflammation and ageing. Nature Reviews Rheumatology. 13, 743 (2017).
- Kuhnke, A., Burmester, G., Krauss, S., Buttgereit, F. Bioenergetics of immune cells to assess rheumatic disease activity and efficacy of glucocorticoid treatment. Annals of the Rheumatic Diseases. 62 (2), 133-139 (2003).
- Kramer, P. A., Ravi, S., Chacko, B., Johnson, M. S., Darley-Usmar, V. M. A review of the mitochondrial and glycolytic metabolism in human platelets and leukocytes: Implications for their use as bioenergetic biomarkers. Redox Biology. 2, 206-210 (2014).
- Garrabou, G., et al. The Effects of Sepsis on Mitochondria. The Journal of Infectious Diseases. 205 (3), 392-400 (2012).
- Mittal, M., Siddiqui, M. R., Tran, K., Reddy, S. P., Malik, A. B. Reactive oxygen species in inflammation and tissue injury. Antioxidants & Redox Signaling. 20 (7), 1126-1167 (2014).
- Adrie, C., et al. Mitochondrial Membrane Potential and Apoptosis Peripheral Blood Monocytes in Severe Human Sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164 (3), 389-395 (2001).
- Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).
- Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of Visualized Experiments. (46), e2511 (2010).
- Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. J. Metabolic characterization of polarized M1 and M2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis. Journal of Visualized Experiments. (105), e53424 (2015).
- Boutagy, N. E., et al. Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments. (104), e53216 (2015).
- Yellen, S. B., Cella, D. F., Webster, K., Blendowski, C., Kaplan, E. Measuring fatigue and other anemia-related symptoms with the Functional Assessment of Cancer Therapy (FACT) measurement system. Journal of Pain and Symptom Management. 13 (2), 63-74 (1997).
- Yost, K. J., Eton, D. T., Garcia, S. F., Cella, D. Minimally important differences were estimated for six Patient-Reported Outcomes Measurement Information System-Cancer scales in advanced-stage cancer patients. Journal of Clinical Epidemiology. 64 (5), 507-516 (2011).
- Kang, J. -. G., Wang, P. -. y., Hwang, P. M., Galluzzi, L., Kroemer, G. . Methods in Enzymology. 542, 209-221 (2014).
- Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Laboratory Investigation. 93 (6), 690-700 (2013).
- Jones, L. J., Gray, M., Yue, S. T., Haugland, R. P., Singer, V. L. Sensitive determination of cell number using the CyQUANT® cell proliferation assay. Journal of Immunological Methods. 254 (1), 85-98 (2001).
- Hartman, M. -. L., et al. Relation of mitochondrial oxygen consumption in peripheral blood mononuclear cells to vascular function in type 2 diabetes mellitus. Vascular Medicine. 19 (1), 67-74 (2014).
