Оценивая роль митохондриальной функции в связанных с раком усталость
Summary
Нашей целью было разработать практический протокол для оценки митохондриальной дисфункции, связанные с усталостью в раковых больных. Этот инновационный протокол оптимизирован для клинического использования с участием только стандартные кровопускания и основных лабораторных процедур.
Abstract
Усталость является общей и изнурительных условие, которое затрагивает большинство больных раком. На сегодняшний день, усталость остается плохо характеризуется не диагностический тест объективно измерить тяжесть этого состояния. Здесь мы описываем оптимизированный метод для оценки митохондриальной функции получения, собранных из усталость раковых больных. Используя компактный внеклеточного потока системы и впрыска респираторные ингибиторы, мы изучили КСДОР митохондриальной функциональное состояние, измеряя базальную митохондриальное дыхание, запасные дыхательных емкости и фенотип энергии, который описывает предпочтительной энергии путь реагировать на стресс. Свежий получения легко доступны в клинических условиях, с использованием стандартных кровопускания. Весь assay, указанных в настоящем Протоколе может быть завершена в менее чем 4 часа без участия сложных биохимических методов. Кроме того мы описываем метод нормализации, который необходим для получения воспроизводимых данных. Простые процедуры и нормализации представленные методы позволяют повторных проб от того же пациента и поколения воспроизводимость данных, которые могут быть сопоставлены между моментами времени оценить потенциальные эффекты лечения.
Introduction
Усталость является распространенным и мучительное условие, что оказывает негативное воздействие на качество жизни больных раком1. К этой дате усталость рак остается плохо определены и полагается только на субъективных отчетности больных2. Таким образом существует настоятельная необходимость определить легко адаптируемые диагностических лабораторных испытаний объективно характеризовать усталость в клинических условиях3,4.
Были предложены несколько основных механизмов, включая дисфункцию митохондрии, вызвать усталость5. Митохондрии являются органеллы электростанция, обеспечивая 95% потребностей клеточной энергии через окислительное фосфорилирование и играть важную роль в сигнализации кальция, апоптоз, иммунные сигнализации и регулирование других внутриклеточных сигнальных события6 . Соответственно нарушение митохондриальной биоэнергетики и дефекты в производстве энергии может способствовать усталости. Поддерживая эту гипотезу, предыдущих исследований наблюдали мутации в митохондриальной ДНК у больных с синдромом хронической усталости7. Хотя она остается неясным ли патофизиологические происхождения усталости лежит в пределах центральной нервной системы или периферических тканях, например, скелетных мышц8,9, в настоящее время нет прямой метод, чтобы точно оценить митохондриальной дисфункции, относящиеся к усталости в живой, дышащими клетками.
С помощью мононуклеаров периферической крови (получения) для изучения функции митохондрий предлагает несколько преимуществ. Во-первых получения легко доступны в клинических условиях, с использованием стандартных кровопускания и могут быть изолированы, быстро, используя основные лабораторные методы. Во-вторых сбор крови менее инвазивна, чем сбор других тканей, таких как биопсия мышц. Таким образом могут быть собраны образцы крови из той же пациентки неоднократно с течением времени, что облегчает Продольная Оценка эффектов лечения. Интересно, что функции митохондрий в репликацию, как представляется, быть хорошо коррелирует с митохондриальных статус почек в животной модели10. Кроме того иммунных клеток митохондрий используются в качестве прокси-сервера для обнаружения системных изменений при различных заболевания условия11,12. Митохондрий в циркулирующие иммунные клетки особенно чувствительны к изменениям в иммунной функции и иммунных сигнальных молекул, таких как цитокинов13,14,15. Например было отмечено, что получения от пациентов с острой ревматической воспалительных заболеваний exhibit потребление кислорода высокой базовой14. Напротив потребление кислорода был сокращен в репликацию, изолированы от пациентов с системных воспалительных процессах, включая сепсис16. При воспалительных процессах свободные радикалы, производимые неблагополучных митохондрий может способствовать дальнейшему повышенный Оксидативный стресс и длительное воспаление17. Центральная роль митохондрий в производстве энергии, а также окислительного стресса предполагает потенциальную полезность использования функции митохондрий как прокси для изучения усталость в раковых больных 13.
Предыдущие исследования, изучение митохондриальной функции используются биохимические методы, измерение потенциала митохондриальной мембраны или изоляции определенных клеточных популяций, которые не могут быть легко адаптированы в клинических условиях5, 14,18. В последние годы развитие внеклеточного потока анализов позволило исследователям легко и точно проанализировать изменения в скорости потребления кислорода (OCR) в ответ на автоматизированных инъекции респираторные ингибиторы19,20 , 21 , 22. Однако большинство из этих исследований предназначены для типов конкретных клеток и большой формат высокой пропускной способности не могут быть применимы в клинических условиях. В этой рукописи мы описываем оптимизированный протокол для изучения митохондриальной функции для клинического использования.
Protocol
Representative Results
Discussion
Усталость в онкологических больных является изнурительной условии, что не является хорошо определенным или характеризуется1. Диагноз усталости полностью основывается на субъективной отчетности и нет текущий стандарт диагностики или лечения этого состояния, во многом об…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование полностью поддерживается Отделом интрамуральных исследований из Национального института сестринского исследований низ, Бетесда, штат Мэриленд.
Materials
| CPT Mononuclear Cells Preparation Tube | BD Biosciences | 362761 | For isolating PBMCs following phlebotomy |
| RPMI-1640 | Corning | 10-040 | For making growth media for PBMCs |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | For making growth media for PBMCs |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | For making growth media for PBMCs |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface |
| Seahorse XF Calibrant Solution | Agilent | 103059-000 | For hydrating cartridges |
| XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges) | Agilent | 103022-100 | Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges |
| XF base media | Agilent | 103335-100 | For making XF assay media |
| 45% cell culture D-(+)-Glucose solution | Corning | 25-037-CI | For making XF assay media |
| Sodium pyruvate solution | Corning | 25-000-CI | For making XF assay media |
| L-glutamine solution | ThermoFisher | 25030081 | For making XF assay media |
| Seahorse XFp Mito Stress Test Kit | Agilent | 103010-100 | Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone |
| CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay | ThermoFisher | C35011 | For quantification of live cells and data normalization |
| Seahorse XFp Analyzer | Agilent | S7802AEA | For measuring mitochondrial function in live cells |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate) | BioTek | BTCYT5PV | For quantification of live cells and data normalization |
References
- Berger, A. M., et al. Cancer-Related Fatigue, Version 2.2015. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 13 (8), 1012-1039 (2015).
- Feng, L. R., Dickinson, K., Kline, N., Saligan, L. N. Different phenotyping approaches lead to dissimilar biologic profiles in men with chronic fatigue following radiation therapy. Journal of Pain and Symptom Management. 52 (6), 832-840 (2016).
- Feng, L. R., et al. Clinical Predictors of Fatigue in Men With Non-Metastatic Prostate Cancer Receiving External Beam Radiation Therapy. Clinical Journal of Oncology Nursing. 19 (6), 744-750 (2015).
- Feng, L. R., Wolff, B. S., Lukkahatai, N., Espina, A., Saligan, L. N. Exploratory Investigation of Early Biomarkers for Chronic Fatigue in Prostate Cancer Patients Following Radiation Therapy. Cancer Nursing. 40 (3), 184-193 (2017).
- Myhill, S., Booth, N. E., McLaren-Howard, J. Chronic fatigue syndrome and mitochondrial dysfunction. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 2 (1), 1-16 (2009).
- Pernas, L., Scorrano, L. Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function. Annual Review of Physiology. 78 (1), 505-531 (2016).
- Vecchiet, L., et al. Sensory characterization of somatic parietal tissues in humans with chronic fatigue syndrome. Neuroscience Letters. 208 (2), 117-120 (1996).
- Jones, D. E. J., Hollingsworth, K. G., Taylor, R., Blamire, A. M., Newton, J. L. Abnormalities in pH handling by peripheral muscle and potential regulation by the autonomic nervous system in chronic fatigue syndrome. Journal of Internal Medicine. 267 (4), 394-401 (2010).
- Feng, L. R., Suy, S., Collins, S. P., Saligan, L. N. The role of TRAIL in fatigue induced by repeated stress from radiotherapy. Journal of Psychiatric Research. 91, 130-138 (2017).
- Karamercan, M. A., et al. Can peripheral blood mononuclear cells be used as a proxy for mitochondrial dysfunction in vital organs during hemorrhagic shock and resuscitation. Shock. 40 (6), (2013).
- Ijsselmuiden, A. J. J., et al. Circulating white blood cells and platelets amplify oxidative stress in heart failure. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 5, 811 (2008).
- Kong, C. -. W., et al. Leukocyte mitochondrial alterations after cardiac surgery involving cardiopulmonary bypass: Clinical correlations. Shock. 21 (4), 315-319 (2004).
- Straub, R. H. The brain and immune system prompt energy shortage in chronic inflammation and ageing. Nature Reviews Rheumatology. 13, 743 (2017).
- Kuhnke, A., Burmester, G., Krauss, S., Buttgereit, F. Bioenergetics of immune cells to assess rheumatic disease activity and efficacy of glucocorticoid treatment. Annals of the Rheumatic Diseases. 62 (2), 133-139 (2003).
- Kramer, P. A., Ravi, S., Chacko, B., Johnson, M. S., Darley-Usmar, V. M. A review of the mitochondrial and glycolytic metabolism in human platelets and leukocytes: Implications for their use as bioenergetic biomarkers. Redox Biology. 2, 206-210 (2014).
- Garrabou, G., et al. The Effects of Sepsis on Mitochondria. The Journal of Infectious Diseases. 205 (3), 392-400 (2012).
- Mittal, M., Siddiqui, M. R., Tran, K., Reddy, S. P., Malik, A. B. Reactive oxygen species in inflammation and tissue injury. Antioxidants & Redox Signaling. 20 (7), 1126-1167 (2014).
- Adrie, C., et al. Mitochondrial Membrane Potential and Apoptosis Peripheral Blood Monocytes in Severe Human Sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164 (3), 389-395 (2001).
- Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).
- Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of Visualized Experiments. (46), e2511 (2010).
- Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. J. Metabolic characterization of polarized M1 and M2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis. Journal of Visualized Experiments. (105), e53424 (2015).
- Boutagy, N. E., et al. Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments. (104), e53216 (2015).
- Yellen, S. B., Cella, D. F., Webster, K., Blendowski, C., Kaplan, E. Measuring fatigue and other anemia-related symptoms with the Functional Assessment of Cancer Therapy (FACT) measurement system. Journal of Pain and Symptom Management. 13 (2), 63-74 (1997).
- Yost, K. J., Eton, D. T., Garcia, S. F., Cella, D. Minimally important differences were estimated for six Patient-Reported Outcomes Measurement Information System-Cancer scales in advanced-stage cancer patients. Journal of Clinical Epidemiology. 64 (5), 507-516 (2011).
- Kang, J. -. G., Wang, P. -. y., Hwang, P. M., Galluzzi, L., Kroemer, G. . Methods in Enzymology. 542, 209-221 (2014).
- Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Laboratory Investigation. 93 (6), 690-700 (2013).
- Jones, L. J., Gray, M., Yue, S. T., Haugland, R. P., Singer, V. L. Sensitive determination of cell number using the CyQUANT® cell proliferation assay. Journal of Immunological Methods. 254 (1), 85-98 (2001).
- Hartman, M. -. L., et al. Relation of mitochondrial oxygen consumption in peripheral blood mononuclear cells to vascular function in type 2 diabetes mellitus. Vascular Medicine. 19 (1), 67-74 (2014).
