Genetische Analyse der erblichen Transthyretin-Ala97Ser im Zusammenhang mit Amyloidose
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll bestätigen das Vorhandensein von Punktmutation für die Diagnose einer erblichen Transthyretin-Amyloidose, mit Ala97Ser, die am häufigsten verwendeten endemische Mutation in Taiwan, als Beispiel.
Abstract
Gentests ist der zuverlässigste Test für erbliche Transthyretin Amyloidose und sollte in den meisten Fällen der Transthyretin-Amyloidose (ATTR) durchgeführt werden. ATTR ist eine seltene, aber tödlichen Krankheit mit heterogenen Phänotypen; Daher wird die Diagnose manchmal verzögert. Mit zunehmender Aufmerksamkeit und breitere Anerkennung auf frühen Äusserungen der ATTR sowie aufstrebenden Behandlungen, geeignete diagnostische Studien, einschließlich der genetischen Transthyretin (TTR) zu testen, um die Typen zu bestätigen und Varianten der ATTR sind daher grundlegender Bedeutung für die Prognose zu verbessern. Genetische Analysen mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Methoden bestätigen das Vorhandensein von TTR Punktmutationen sehr viel schneller und sicherer als herkömmliche Methoden wie Südlicher Fleck. Hier zeigen wir genetische Bestätigung der ATTR Ala97Ser Mutation, die am häufigsten verwendeten endemische Mutation in Taiwan. Das Protokoll umfasst vier Hauptschritte: Sammeln von Vollblut-Probe, DNA-Extraktion, genetische Analyse der alle vier TTR Exons mit PCR und DNA-Sequenzierung.
Introduction
Transthyretin (TTR) Amyloidose (ATTR) ist die häufigste Form des erblichen systemische Amyloidose1und kann durch eine autosomal dominant vererbte Mutation im Transthyretin (TTR) gen2verursacht werden. TTR Mutationen destabilisieren die tetrameres Protein-Struktur und führen zu seiner Dissoziation in Monomere, die Amyloid-Fibrillen2setzt. Mehr als 100 Amyloidogenic TTR Mutationen wurden berichteten weltweit1. Genetische Analysen mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Methoden bestätigen das Vorhandensein von TTR Punktmutation und haben Vorteile, einschließlich den Umgang mit radioaktiv markierte Sonden im Vergleich zu Südlicher Fleck3zu vermeiden. PCR ist eine schnell, einfach, billig und zuverlässige Technik, die auf zahlreichen Feldern in modernen Wissenschaften4angewendet wurde.
Die Früherkennung dieser progressive und tödliche Krankheit ist schwierig, angesichts ihrer phänotypischen Heterogenität. Mit zunehmender Aufmerksamkeit und breitere Anerkennung auf den frühen Manifestationen der ATTR sowie die aufstrebenden Behandlungen5, sind entsprechende diagnostische Untersuchungen einschließlich TTR Gentest daher kritisch grundlegend für die Prognose zu verbessern. Darüber hinaus sind verschiedene Mutationen im Zusammenhang mit unterschiedlicher Penetranz des Merkmals, Erkrankungsalter, Muster der Progression, schwere der Erkrankung, mediane Überlebenszeit, Wirksamkeit der Lebertransplantation oder TTR Stabilisatoren2,6, und Variable Grad der neurologischen und kardiologischen Beteiligung, die große Auswirkungen auf die genetische Beratung7,8,9haben. Ein hochgenauer Gentest ist übrigens das einzige Werkzeug, das unterscheidet zwei verschiedenen Arten von ATTR: erbliche (mutierten) und Wildtyp (nicht mutierte Form, senile systemische Amyloidose, SSA)7. Es ist zwingend notwendig, um die Arten von ATTR, bestätigen, weil die Therapien2unterschiedlich. Daher ist eine zunehmende Notwendigkeit, das schrittweise Protokoll der TTR-Gentest zu beschreiben.
Die molekularen Ansatz zu erkennen, die Mutation wird mit Ala97Ser, die am häufigsten verwendeten endemische Mutation in Taiwan, als Beispiel veranschaulicht werden. Änderungen in der DNA-Extraktionsschritt reduzieren die Menge der drei Lösungen verwendet und liefert eine ausreichende Menge an DNA. In diesem Protokoll alle vier TTR Exons wurden analysiert, während Regionen einschließlich 5′ stromaufwärts, 3′ flussabwärts, Promotoren, Introns und unübersetzte Regionen (UTR) wurden nicht sequenziert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt zwei wichtige Schritte im Rahmen des Protokolls. Erstens sollte ein Hemodiluted Exemplar um ausreichende Anzahl von weißen Blutkörperchen, vermiedene11. Zweitens ist die Verwendung von entsprechenden PCR Primer grundlegend für zuverlässige Ergebnisse12zu erhalten. Wir verwendet die Primer-BLAST-Web-Tool, um Primer4,13zu entwerfen; ein Minimum von 40 Basenpaare auf jeder Seite vier TTR Exons sollten abged…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir wollen Miss Shin-Fun Wu für ihre Hilfe in den Experimenten zu danken. Diese Studie wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus dem Chang Gung Medical Research Program (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) und IRB 100-4470A3, 104-2462A3, Taiwan.
Materials
| EDTA-treated tubes | BD | ||
| DNA Extraction Kit | Stratagen | 200600 | |
| NanoDrop ND2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | Kimtech Science Kimwipes | |
| AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase kit | Applied Biosystems | 4398823 | |
| TTR gene intronic primers | Exon1 | F: 5’-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3’ | |
| Exon1 | R: 5’-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3’ | ||
| Exon2 | F: 5’-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3’ | ||
| Exon2 | R: 5’-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3’ | ||
| Exon3 | F: 5’-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3’ | ||
| Exon3 | R: 5’-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3’ | ||
| Exon4 | F: 5’-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3’ | ||
| Exon4 | R: 5’-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3’ | ||
| thermocycler | Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| electrophoresis cell | ADVANCE | Mupid-2plus | |
| DNA ladder | Protech | PT-M1-100 | |
| dye | BioLabs | B7021 | |
| AlphaImager EC | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| automatic sequencer | Applied Biosystems | 3730xl DNA Analyzer |
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