遺伝性トランスサイレチン Ala97Ser の遺伝子解析関連アミロイド症
Summary
ここでは、例として Ala97Ser、台湾では、最も一般的な風土病突然変異を使用して遺伝性トランスサイレチンのアミロイド症の診断のための点突然変異の存在を確認するためのプロトコルを提示します。
Abstract
遺伝学的検査は遺伝性トランスサイレチンの最も信頼性の高いテスト関連のアミロイドーシスとトランスサイレチン アミロイドーシス (ATTR) のほとんどのケースで実行する必要があります。ATTR が異種表現型; でまれな、致命的な病気したがって、診断が遅れることもあります。関心と新たな治療法と同様、ATTR の初期症状の広範な認識を増やすこと、適切な診断の研究、トランスサイレチン (TTR) 遺伝子を含むテスト、種類を確認して ATTR の亜種が基本的な予後の改善に。ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 方法と遺伝学的解析がより迅速に TTR ポイント突然変異の存在を確認、南しみなどの従来の方法よりも安全です。ここで、ATTR Ala97Ser 突然変異、台湾で最も一般的な風土病突然変異の遺伝学的確認を示します。プロトコルには 4 つの主要なステップが装備されている: 収集全血試料、DNA の抽出、PCR とすべての 4 つ TTR エクソンの遺伝学的解析および DNA の配列。
Introduction
トランスサイレチン (TTR) アミロイドーシス (ATTR) 遺伝性の全身性アミロイドーシスの1、最も一般的な形式し、トランスサイレチン (TTR) 遺伝子2常染色体優性遺伝の突然変異によって引き起こされることができます。TTR 変異 4 量体タンパク質の構造を不安定にし、アミロイド線維2に再アセンブル単量体への解離に 。以上 100 アミロイド TTR の突然変異は報告されている世界的な1をされています。ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 方法と遺伝学的解析は TTR ポイント突然変異の存在を確認、南しみ3と比較して放射能によって分類されたプローブの処理を回避するなどの利点があります。PCR は、現代の科学4における多数のフィールドに適用されている高速、簡単、安価で、信頼性の高い手法です。
その表現型の多様性を与えられて、この進行と致命的な病気の早期診断は困難です。注意と新興治療5と同様、ATTR の初期症状の広範な認識に伴い、TTR 遺伝子検査を含む適切な診断学的意義、予後を改善するために非常に基本的なしたがって。さらに、異なる突然変異形質の異なる浸透度、発症年齢、進行疾患の重症度、生存期間中央値、肝移植や TTR スタビライザー2,6の有効性のパターンに関連付けられているし、遺伝カウンセリング7,8,9に大きな影響を与える神経と心の関与の可変度。その上、高精度の遺伝子検査は ATTR の 2 つのタイプを区別する唯一のツール: 遺伝性 (突然変異) と野生型 (非突然変異体の形態、老人性全身性アミロイドーシス、SSA)7。2に治療法が異なるため、属性の種類を確認することが不可欠です。したがって、TTR 遺伝子検査の段階的なプロトコルを記述する必要性がますますあります。
突然変異を検出する分子のアプローチは、例として Ala97Ser、台湾では、最も一般的な風土病突然変異を使用して説明されます。DNA 抽出手順の変更は使用される 3 つのソリューションの量を減らすし、DNA の十分な量が得られます。このプロトコルでは 5′ 上流、3′ 下流、プロモーター、イントロンを含む地域中のすべての 4 つの TTR エクソンが行ったし、非翻訳領域 (UTR) クローニングされたないです。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコル内で 2 つの重要な手順があります。まず、白血球細胞の十分な数を持つために hemodiluted 試験片は回避11をする必要があります。第二に、適切な PCR のプライマーの使用は信頼性の高い結果12を取得する基本的です。プライマー ブラスト web ツールを使用してプライマー4,13; を設計するには4 つの TTR エク…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 は実験にミス新楽しい呉を感謝したいと思います。本研究は、チャン庚医学研究プログラム (CMRPG3C0371、CMRPG3C0372、CMRPG3C0373) および IRB 100-4470A3、104-2462A3、台湾からの助成金によって支えられました。
Materials
| EDTA-treated tubes | BD | ||
| DNA Extraction Kit | Stratagen | 200600 | |
| NanoDrop ND2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | Kimtech Science Kimwipes | |
| AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase kit | Applied Biosystems | 4398823 | |
| TTR gene intronic primers | Exon1 | F: 5’-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3’ | |
| Exon1 | R: 5’-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3’ | ||
| Exon2 | F: 5’-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3’ | ||
| Exon2 | R: 5’-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3’ | ||
| Exon3 | F: 5’-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3’ | ||
| Exon3 | R: 5’-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3’ | ||
| Exon4 | F: 5’-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3’ | ||
| Exon4 | R: 5’-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3’ | ||
| thermocycler | Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| electrophoresis cell | ADVANCE | Mupid-2plus | |
| DNA ladder | Protech | PT-M1-100 | |
| dye | BioLabs | B7021 | |
| AlphaImager EC | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| automatic sequencer | Applied Biosystems | 3730xl DNA Analyzer |
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