Genetische analyse van erfelijke Transthyretin Ala97Ser gerelateerde amyloidose
Summary
Hier presenteren we een protocol ter bevestiging van de aanwezigheid van punt mutatie voor de diagnose van erfelijke transthyretin amyloidose, met behulp van Ala97Ser, de meest voorkomende endemisch mutatie in Taiwan, als voorbeeld.
Abstract
Genetische tests is de meest betrouwbare test voor erfelijke transthyretin gerelateerde amyloidose en in de meeste gevallen van transthyretin Amyloïdose (ATTR) moet worden uitgevoerd. ATTR is een zeldzame maar fatale ziekte met heterogene fenotypen; de diagnose wordt daarom soms uitgesteld. Met de toenemende aandacht en bredere erkenning op vroege uitingen van ATTR evenals opkomende behandelingen, passende diagnostische studies, met inbegrip van de transthyretin (TTR) genetische testen, om te bevestigen de types en varianten van ATTR zijn daarom fundamentele ter verbetering van de prognose. Genetische analyses met polymerase kettingreactie (PCR) methoden bevestigen de aanwezigheid van TTR puntmutaties veel sneller en veiliger dan met conventionele methoden zoals zuidelijke vlek. Hierin tonen wij genetische bevestiging van de ATTR Ala97Ser mutatie, de meest voorkomende endemisch mutatie in Taiwan. Het protocol omvat vier hoofdstappen: het verzamelen van volbloed specimen, DNA-extractie, genetische analyse van alle vier TTR exons met PCR, en DNA sequencing.
Introduction
Transthyretin (TTR) amyloidose (ATTR) is de meest voorkomende vorm van erfelijke systemische amyloidose1, en kan worden veroorzaakt door een autosomaal dominant erfelijke mutatie in het gen transthyretin (TTR)2. TTR mutaties destabiliseren het tetramere eiwitstructuur en leiden tot haar dissociatie in monomeren die herassembleert in amyloïde fibrillen2. Meer dan 100 amyloidogenic TTR mutaties zijn gerapporteerde wereldwijd1. Genetische analyses met polymerase kettingreactie (PCR) methoden bevestigen de aanwezigheid van TTR punt mutatie en voordelen, waaronder het vermijden van de behandeling van radioactief gelabelde sondes in vergelijking met de zuidelijke vlek3hebben. PCR is een snelle, eenvoudige, goedkope en betrouwbare techniek die is toegepast op tal van gebieden in moderne wetenschappen4.
De vroegtijdige diagnose van deze progressieve en dodelijke ziekte is uitdagend gegeven haar fenotypische heterogeniteit. Met toenemende aandacht en bredere erkenning op de vroege uitingen van ATTR evenals de opkomende behandelingen5, zijn passende diagnostische studies, met inbegrip van TTR genetische test daarom kritisch fundamenteel voor het verbeteren van de prognose. Bovendien verschillende mutaties zijn geassocieerd met verschillende doordringendheid van de Trek, leeftijd van intreden, patronen van progressie, ernst van de ziekte, mediane overleving, werkzaamheid of lever transplantatie, TTR stabilisatoren2,6, en variabele graden van neurologische en cardiologische betrokkenheid, die grote gevolgen voor genetische counseling7,8,9 hebben. Bovendien, een zeer nauwkeurige genetische test is het enige hulpmiddel dat de twee verschillende soorten ATTR onderscheidt: erfelijke (mutant) en wild-type (niet-mutant vorm, seniele systemische amyloidose, SSA)7. Het is noodzakelijk om te bevestigen de soorten ATTR, omdat de therapieën2sterk uiteenlopen. Daarom is er een toenemende noodzaak om te beschrijven de stapsgewijze protocol van de TTR genetische test.
De moleculaire benadering om op te sporen van de mutatie wordt geïllustreerd met behulp van Ala97Ser, de meest voorkomende endemisch mutatie in Taiwan, als voorbeeld. Wijzigingen in de DNA-extractie stap verminderen het bedrag van de drie oplossingen gebruikt en levert van een voldoende hoeveelheid van DNA. In dit protocol, alle vier TTR exons werden geanalyseerd, terwijl de regio’s, met inbegrip van 5′ stroomopwaarts 3′ stroomafwaarts, initiatiefnemers, introns, en niet-vertaalde regio’s (UTR) waren niet gesequentieerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn twee belangrijke stappen in het protocol. Eerst, om voldoende aantal witte bloedcellen hebben een hemodiluted monster moet vermeden11. Ten tweede, het gebruik van passende PCR inleidingen is fundamenteel voor het verkrijgen van betrouwbare resultaten12. We gebruikten het gereedschap van de web Primer-BLAST te ontwerpen de inleidingen4,13; een minimum van 40 basenparen aan weerskanten van de vier TTR exons mo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij willen Miss Shin-Fun Wu bedanken voor haar hulp bij de experimenten. Deze studie werd gesteund door een subsidie van de Chang Gung medische Research Program (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) en IRB 100-4470A3, 104-2462A3, Taiwan.
Materials
| EDTA-treated tubes | BD | ||
| DNA Extraction Kit | Stratagen | 200600 | |
| NanoDrop ND2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | Kimtech Science Kimwipes | |
| AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase kit | Applied Biosystems | 4398823 | |
| TTR gene intronic primers | Exon1 | F: 5’-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3’ | |
| Exon1 | R: 5’-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3’ | ||
| Exon2 | F: 5’-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3’ | ||
| Exon2 | R: 5’-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3’ | ||
| Exon3 | F: 5’-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3’ | ||
| Exon3 | R: 5’-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3’ | ||
| Exon4 | F: 5’-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3’ | ||
| Exon4 | R: 5’-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3’ | ||
| thermocycler | Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| electrophoresis cell | ADVANCE | Mupid-2plus | |
| DNA ladder | Protech | PT-M1-100 | |
| dye | BioLabs | B7021 | |
| AlphaImager EC | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| automatic sequencer | Applied Biosystems | 3730xl DNA Analyzer |
References
- Planté-Bordeneuve, V., Said, G. Familial amyloid polyneuropathy. The Lancet Neurology. 10 (12), 1086-1097 (2011).
- Planté-Bordeneuve, V., et al. Long-term treatment of transthyretin familial amyloid polyneuropathy with tafamidis: a clinical and neurophysiological study. Journal of Neurology. 264 (2), 268-276 (2017).
- Nichols, W. C., Benson, M. D. Hereditary amyloidosis: detection of variant prealbumin genes by restriction enzyme analysis of amplified genomic DNA sequences. Clinical Genetics. 37 (1), 44-53 (1990).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Hsu, H. C., et al. Phenotypic expressions of hereditary Transthyretin Ala97Ser related Amyloidosis (ATTR) in Taiwanese. BMC Neurology. 17 (1), 178 (2017).
- Barroso, F. A., et al. Long-term safety and efficacy of tafamidis for the treatment of hereditary transthyretin amyloid polyneuropathy: results up to 6 years. Amyloid. 24 (3), 194-204 (2017).
- Rapezzi, C., et al. Disease profile and differential diagnosis of hereditary transthyretin-related amyloidosis with exclusively cardiac phenotype: an Italian perspective. European Heart Journal. 34 (7), 520-528 (2013).
- Mariani, L. L., et al. Genotype-phenotype correlation and course of transthyretin familial amyloid polyneuropathies in France. Annals of Neurology. 78 (6), 901-916 (2015).
- Hammarström, P., Jiang, X., Hurshman, A. R., Powers, E. T., Kelly, J. W. Sequence-dependent denaturation energetics: A major determinant in amyloid disease diversity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 16427-16432 (2002).
- Johnson, M., Zaretskaya, I., Raytselis, Y., Merezhuk, Y., McGinnis, S., Madden, T. L. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, 5-9 (2008).
- Fox, A. J., et al. Next generation sequencing for the detection of actionable mutations in solid and liquid tumors. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Date, Y., Nakazato, M., Kangawa, K., Shirieda, K., Fujimoto, T., Matsukura, S. Detection of three transthyretin gene mutations in familial amyloidotic polyneuropathy by analysis of DNA extracted from formalin-fixed and paraffin-embedded tissues. Journal of the Neurological Sciences. 150 (2), 143-148 (1997).
- Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning: A laboratory manual. , (2012).
- Buckingham, L., Flaws, M. L. . Molecular diagnostics: Fundamentals, methods, and clinical applications. , (2012).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).
- Rapezzi, C., et al. Systemic cardiac amyloidoses: disease profiles and clinical courses of the 3 main types. Circulation. 120 (13), 1203-1212 (2009).
- Gertz, M. A., Dispenzieri, A., Sher, T. Pathophysiology and treatment of cardiac amyloidosis. Nature Reviews Cardiology. 12 (2), 91-102 (2015).
- Vrana, J. A., et al. Clinical diagnosis and typing of systemic amyloidosis in subcutaneous fat aspirates by mass spectrometry-based proteomics. Haematologica. 99 (7), 1239-1247 (2014).
- Nakamura, M., et al. Identification of a new transthyretin variant (Ile49) in familial amyloidotic polyneuropathy using electrospray ionization mass spectrometry and nonisotopic RNase cleavage assay. Human Heredity. 49 (4), 186-189 (1999).
- Ueda, M., Ando, Y. Recent advances in transthyretin amyloidosis therapy. Translational Neurodegeneration. 3, 19 (2014).
- Brown, E. E., et al. Genetic testing improves identification of transthyretin amyloid (ATTR) subtype in cardiac amyloidosis. Amyloid. 24 (2), 92-95 (2017).
- Tasaki, M., et al. Rapid detection of wild-type and mutated transthyretins. Annals of Clinical Biochemistry. 53 (4), 508-510 (2015).
- Plante-Bordeneuve, V., et al. Diagnostic pitfalls in sporadic transthyretin familial amyloid polyneuropathy (TTR-FAP). Neurology. 69 (7), 693-698 (2007).
- Hsu, J. L., et al. A prospective, observational study of patients with uncommon distal symmetric painful small-fiber neuropathy. PLoS ONE. 12 (9), 0183948 (2017).
- Salvi, F., Pastorelli, F., Plasmati, R., Bartolomei, I., Dall’Osso, D., Rapezzi, C. Genotypic and phenotypic correlation in an Italian population of hereditary amyloidosis TTR-related (HA-TTR): Clinical and neurophysiological aids to diagnosis and some reflections on misdiagnosis. Amyloid. 19, 58-60 (2012).
- Suhr, O. B., Lundgren, E., Westermark, P. One mutation, two distinct disease variants: Unravelling the impact of transthyretin amyloid fibril composition. Journal of Internal Medicine. 281 (4), 337-347 (2017).
- Vilà-Rico, M., et al. Quantitative analysis of post-translational modifications in human serum transthyretin associated with familial amyloidotic polyneuropathy by targeted LC-MS and intact protein MS. Journal of Proteomics. 127, 234-246 (2015).
